直鎖状ユビキチン産生酵素(LUBAC)の相互作用因子探索と生理機能解析

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15H04694
• 研究機関: 群馬大学
• 研究代表者: 徳永 文稔 群馬大学, 生体調節研究所, 教授 (00212069)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: シグナル伝達 / 蛋白質 / 免疫学 / 細胞・組織 / 生理活性

研究実績の概要

NF-κBは炎症や免疫を制御する転写因子で、我々は直鎖状ユビキチン鎖を特異的に生成するLUBACユビキチンリガーゼがNF-κB経路を活性化することを明らかにした。これは、直鎖状ユビキチン結合ドメインを含有するタンパク質は、LUBACによる炎症応答や免疫制御に重要な役割を果たすことを示唆する。そこで本研究で我々は、典型的な直鎖状ユビキチン結合ドメイン（UBANドメイン）をもち、緑内障や筋萎縮性側索硬化症(ALS)発症に関わるoptineurin(OPTN)について解析した。
まず我々は、野生型及び12種の疾患関連OPTN変異体を作製し、LUBACによるNF-κB活性化への影響を調べた。その結果、野生型および緑内障を引き起こすOPTN変異体はNF-κB活性化を抑制したが、ALS関連OPTN変異体はNF-κB活性阻害能を失っていた。さらに、共結晶構造を解析を行い、2分子のOPTN-UBANの両側に直鎖状ユビキチンが結合していることを明らかにした。また、CRISPR/Cas9法を用いてOPTNノックアウトHeLa細胞を作製し、NF-κB活性化を解析したところ、OPTN欠損によってNF-κB活性化が亢進した。同様に、アポトーシスもOPTN-KO細胞で亢進することが示された。さらに、OPTN変異によるALS患者由来の組織標本染色から、これら患者の運動ニューロンでは直鎖状ユビキチンや活性型NF-κB因子が細胞質にTDP-43と共局在する凝集体を形成していること、このような細胞ではカスパーゼ３が活性化していることを見いだした。本研究から、OPTNは正常細胞ではNF-κBと細胞死を抑制しているが、ALSを引き起こす変異体発現下ではNF-κB活性が亢進し、p65や直鎖状ユビキチンが細胞内で凝集するためアポトーシスを引き起こすこと、このため最終的にALSに至る可能性が示された。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

我々は、既に直鎖状ユビキチン結合タンパク質optineurin(OPTN)の直鎖状ユビキチン結合性がOPTNによるNF-κB活性抑制に必須であること、OPTNと直鎖状ユビキチンとの共結晶の構造生物学的解明、OPTN欠損細胞でのNF-κBとアポトーシス制御、筋萎縮性側索硬化症(ALS)患者の病理組織における直鎖状ユビキチンや活性化型NF-κBの蓄積など重要な知見を見いだし、論文を投稿できる段階に達した。今後、詳細な病理解析を進めて疾患との関連を明確にする。

今後の研究の推進方策

新規LUBAC会合タンパク質群の細胞・個体レベルでの機能解析
１．各種細胞におけるLUBAC複合体の同定：LUBACによるNF-κB制御は細胞種差やヒトとマウスの動物種差があることが報告されているため、Cas9/CRISPR法でLUBACサブユニットをノックアウトした各種細胞にエピトープタグを連結したLUBACサブユニットを入れ戻し、生化学的な精製を行う。これによって、細胞種によってLUBAC機能の差違をもたらす実体を明らかにする。
２．ノックアウトマウス作製による新規会合タンパク質の生理機能解析：LUBACに会合するタンパク質のうち、in vitroや細胞レベルの解析からNF-κB活性制御に関わることが判明した候補タンパク質について、ノックアウトマウスを作製し、表現型を解析するとともにNF-κBシグナル、自然・獲得免疫応答、アポトーシスなど関連する生理機能を解析する。
３．新規抗炎症剤探索を目指したNF-κB活性阻害剤の探索：LUBACは、癌や皮膚炎など炎症性疾患に関連する。LUBACの活性制御には今回同定される会合タンパク質群が細胞・臓器特異的な調節に重要な役割を果たす可能性があり、創薬の標的として注目される。そこで、新規会合タンパク質の結合阻害剤や活性阻害剤を連携研究者とともに、無細胞タンパク質発現系でアルファスクリーン法を用いることで探索する。
これらの解析からLUBACや直鎖状ユビキチンに結合し、炎症・免疫制御に関わるタンパク質の同定と生理機能解析を目指す。

研究成果

• [雑誌論文] A novel autosomal recessive mutation of DSG4 causes monilethrix through the ER stress response. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kato M, Shimizu A, Yokoyama Y, Kaira K, Shimomura Y, Ishida-Yamamoto A, Kamei K,Tokunaga F, Ishikawa O
  • 雑誌名: J. Invest. Dermatol. 巻: 135 ページ: 1253-1260
  • DOI: 10.1038/jid.2015.12.
  • 査読あり
• [雑誌論文] LUBAC Formation Is Impaired in the Livers of Mice with MCD-Dependent Nonalcoholic Steatohepatitis. (2015)
  • 著者名/発表者名: Matsunaga Y, Nakatsu Y, Fukushima T, Okubo H, Iwashita M, Sakoda H, Fujishiro M, Yamamotoya T, Kushiyama A, Takahashi S, Tsuchiya Y, Kamata H, Tokunaga F, Iwai K, Asano T
  • 雑誌名: Mediators Inflamm 巻: 2015 ページ: 125380
  • DOI: 10.1155/2015/125380.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The Structural Differences between a Glycoprotein Specific F-Box Protein Fbs1 and Its Homologous Protein FBG3. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kumanomidou T, Nishio K, Takagi K, Nakagawa T, Suzuki A, Yamane T, Tokunaga F, Iwai K, Murakami A, Yoshida Y, Tanaka K, Mizushima T
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 10 ページ: e0140366
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0140366.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A20 targets caspase-8 and FADD to protect HTLV-I-infected cells. (2015)
  • 著者名/発表者名: Saitoh Y, Hamano A, Mochida K, Kakeya A, Uno M, Tsuruyama E, Ichikawa H, Tokunaga F, Utsunomiya A, Watanabe T, Yamaoka S
  • 雑誌名: Leukemia 巻: 30 ページ: 716-726
  • DOI: 10.1038/leu.2015.267
  • 査読あり
• [学会発表] Generalized verrucosis caused by a GATA2 deficiency. (2015)
  • 著者名/発表者名: Hattori M, Shimizu A, Amano H, Ishikawa O, Mitsui T, Kaira K, Oikawa D, Tokunaga F, Nakano H, and Sawamura D.
  • 学会等名: 第41回日本研究皮膚科学会
  • 発表場所: 岡山
  • 年月日: 2015-12-11 – 2015-12-13
• [学会発表] 直鎖状ユビキチン鎖産生酵素(LUBAC)の新規調節因子の同定と免疫・炎症制御 (2015)
  • 著者名/発表者名: 阿部貴則、及川大輔、高橋宏隆、澤崎達也、徳永文稔
  • 学会等名: BMB2015
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] T細胞受容体(TCR)を介したNF-κB活性化機構におけるLUBACの関与 (2015)
  • 著者名/発表者名: 後藤栄治、徳永文稔
  • 学会等名: BMB2015
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] 直鎖状ユビキチン鎖を介したNF-κB活性化を制御する脱ユビキチン化酵素の探索 (2015)
  • 著者名/発表者名: 片山雄貴、後藤栄治、徳永文稔
  • 学会等名: BMB2015
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] コムギ無細胞系を基盤としたインタラクトーム解析に向けた脱ユビキチン化酵素プロテインアレイの構築 (2015)
  • 著者名/発表者名: 土居耕介、高橋宏隆、後藤栄治、徳永文稔、澤崎達也
  • 学会等名: BMB2015
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] コムギ無細胞ヒト20,000種プロテインアレイを基盤とした直鎖状ユビキチン鎖結合タンパク質の探索 (2015)
  • 著者名/発表者名: 中島達朗、高橋宏隆、竹田浩之、徳永文稔、澤崎達也
  • 学会等名: BMB2015
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] 脱ユビキチン化酵素CYLDを分解し、がん化を促進するE3リガーゼの同定・解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 上松篤史、高橋宏隆、竹田浩之、徳永文稔、山田六平、宮崎洋平、澤崎達也
  • 学会等名: BMB2015
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] 非アルコール性脂肪性肝炎におけるLUBAC形成傷害の解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 松永泰花、中津祐介、福嶋俊明、大久保博史、岩下未咲、迫田秀之、藤城緑、山本屋武、櫛山暁史、高橋伸一郎、土谷佳弘、鎌田英明、徳永文稔、岩井一宏、浅野知一郎
  • 学会等名: BMB2015
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] コムギ無細胞系を基盤とした脱ユビキチン化酵素CYLDおよびOTULINの阻害剤開発 (2015)
  • 著者名/発表者名: 山中聡士、高橋宏隆、徳永文稔、澤崎達也
  • 学会等名: BMB2015
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] Optineurin遺伝子変異に伴うALS発症における直鎖状ポリユビキチン鎖の寄与 (2015)
  • 著者名/発表者名: 及川大輔、中澤世識、石井亮平、綾木孝、石谷隆一郎、伊東秀文、濡木理、徳永文稔
  • 学会等名: 第10回臨床ストレス応答学会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-11-06 – 2015-11-07
• [学会発表] Optineurinによる直鎖状ポリユビキチン鎖結合を介したNF-κBとアポトーシス制御 (2015)
  • 著者名/発表者名: 及川大輔、石井亮平、中澤世識、石谷隆一郎、濡木理、徳永文稔
  • 学会等名: 第67回日本細胞生物学会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-06-30 – 2015-07-02
• [学会発表] Linear ubiquitin-binding by optineurin regulates NF-κB activation and apoptosis. (2015)
  • 著者名/発表者名: Tokunaga F
  • 学会等名: 15th International TNF Conference
  • 発表場所: Ghent, Belgium
  • 年月日: 2015-05-20 – 2015-05-23
  • 国際学会 / 招待講演
• [図書] Protein modifications in pathogenic dysregulation of signaling (2015)
  • 著者名/発表者名: Tokunaga F
  • 総ページ数: 348
  • 出版者: Springer
• [備考] 群馬大学生体調節研究所
  • URL: http://www.imcr.gunma-u.ac.jp/#main-slider/1
• [備考] 群馬大学生体調節研究所分子細胞制御分野
  • URL: http://molcellbiol.imcr.gunma-u.ac.jp