| 研究課題/領域番号 |
15H04696
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| 研究機関 | 中部大学 |
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研究代表者 |
古川 鋼一 中部大学, 生命健康科学部, 教授 (80211530)
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| 研究分担者 |
山内 祥生 名古屋大学, 医学系研究科, 講師 (00444878) [辞退]
大海 雄介 中部大学, 生命健康科学部, 助手 (10584758)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 糖脂質 / シグレック / セラミド / ノックアウト |
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| 研究実績の概要 |
スフィンゴ糖脂質によるシグナル制御機能の基盤にある糖脂質の分子構造のリモデリング細胞の作成とその方法の確立および検証について、前年度から引き続いて基礎的検討を行い、種々の問題点の解決に努めた。とくに、CRISPR/Cas9を用いたゲノム遺伝子のノックアウトの完遂にとって、ガードRNAの選択およびノックアウト細胞の選別法と確認アプローチが、未経験の分野として課題となった。
コントロール細胞株で、ターゲット配列を組み込んだベクターとCas9および候補のガードRNA発現ベクターを発現させ、蛍光発色が明らかに上昇した細胞クローンの取得に難儀したが、遺伝子導入法、導入ベクターの量などの最適化によって条件設定に成功した。また、最初目標としたDes2遺伝子に加えて、脂肪酸の2C部位に水酸基を転移するFA2H遺伝子に関しても、同様にCRISPR/Cas9 法によるノックアウトを行い、最終的に単独遺伝子ノックアウトと両者のダブルノックアウト細胞株を樹立するのに成功した。これらを用いて、セラミド修飾細胞株の形式変化、シグレック７の結合性の変化、NK様細胞との相互作用時のNK様細胞側、GD3発現がん細胞側のシグナル変化につき詳細に解析を進めた。
これらの糖脂質リモデリング細胞の糖脂質化学構造の変化に関して、名古屋大学医学部の分子構造解析室の協力を得て、QTRAP6500 による質量分析解析を行い、ここで目指した脂質部位の修飾の修正に成功していることを証明できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本課題で最も重要なスフィンゴ糖脂質によるシグナル制御機能の基盤にある糖脂質の全体の分子構造のリモデリング細胞の作成法と実際の樹立およびそれらを用いた機能解析について、前年度から引き続いて詳細な基礎的検討を行い、研究法の確立、とくに、CRISPR/Cas9を用いたゲノム遺伝子のノックアウトの細胞レベルでの実施が容易になった点は、今後の実験の遂行において非常に意義が大きい。
HEK293細胞を用いて、ゲノムのターゲット部分を組み込んだベクターとCas9発現ベクターおよびガードRNA候補の発現ベクターを導入し、蛍光発色の違いでベストのガードRNAの選択を行った。これらの試みを経て、遺伝子導入法、導入ベクター量などの至適条件の決定を行った。さらに、長鎖塩基のC4の水酸化に働くDes2遺伝子に加えて、脂肪酸のC2の水酸基酵素であるFA2H遺伝子についても、CRISPR/Cas9 法によるノックアウトを行い、各々単独の遺伝子ノックアウト細胞株と両者のダブルノックアウト細胞株を樹立することができた。よって、セラミド修飾細胞株の形質変化、シグレック７の結合性変化、NK様細胞に対する感受性の変化、相互作用時のNK様細胞およびGD3発現癌細胞側の細胞内シグナル変化につき詳細な解析が可能な技術的基盤を確立した。
また、糖脂質リモデリング細胞の糖脂質化学構造の変化を、名古屋大学医学部の分子構造解析室において、QTRAP6500 による質量分析解析を実施して、セラミド頭部の２箇所の水酸化の除外操作が完遂していることをデータとして示すことができた。
さらに、GD3やGD2が細胞膜上で会合する分子をEMARS/MSにより同定して、その機能をノックアウト法により明らかにすることを目指している。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまで達成した分析結果と、解析技術の向上をふまえて、ガングリオシドGD3やGD2が細胞膜上で会合する分子をEMARS/MSにより同定した後、その機能の詳細とガングリオシドとの複合体形成を、ノックアウト法を駆使して明らかにすることを目指している。
また、岐阜大学 安藤博士との共同研究により、蛍光標識したガングリオシドを用いて細胞膜上における種々の脂質含有ガングリオシドの細胞膜動態とクラスター形成につき検討して、それらの結果とシグレック７の認識・結合性との関連を明らかにする予定である。
さらに、前年に引き続いて、標的細胞膜ガングリオシドの100~300 nm 以内に存在する糖脂質近傍膜分子を、EMARS/MS解析によって同定し、それらの会合の有無とがん細胞における役割に関して、遺伝子ノックアウト法も含めて明らかにしていく。
これらの実験結果が、実際の癌患者の組織において反映されているのかを、大腸癌、悪性黒色腫などの患者の手術標本を用いて明らかにする。とくに、糖脂質の糖鎖プロフィールに加えて、ガングリオシドが結合するセラミドの微細な構造変化と、癌部/非癌部における構造の差異を、段階的に明らかにする。よって、癌細胞の人為的制御を目指す上で効果的なターゲットの化学構造やその修飾酵素の同定と、修飾のための治療アプローチの検討へと発展させたい。
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