ミトコンドリアシグナルによる熱ショック応答の制御機構

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15H04706
• 研究機関: 山口大学
• 研究代表者: 中井 彰 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60252516)
• 研究分担者: 藤本 充章 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80359900) ; 瀧井 良祐 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (00419558)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: シャペロン / 転写 / ストレス / ミトコンドリア / プロテオスタシス

研究実績の概要

これまでの研究から、ストレス誘導性HSF1転写複合体に転写因子ATF1が含まれることを明らかにしている。そこで、SSBP1、HSF1、ATF1とも共沈降するタンパク質群を同定する。そのために、それぞれをFlag標識したタンパク質をヒトHEK293細胞へ発現させた。その細胞を４２℃で０分、２分、５分の熱ストレス処理、１時間熱ストレス処理の後の１時間と３時間の回復の時点で細胞抽出液を作製し、hHSF1、mSSBP1、mATF1と共沈降するタンパク質群をそれぞれ高感度質量分析により同定した。その中でhHSF1、mSSBP1、およびmATF1に共通に含まれる因子として、これまでに解析を行ったヒストンシャペロンFACTが含まれていた。それ以外に一定の頻度で共通に含まれる因子としてRNAプロセッシングに関連するRNA結合タンパク質HNRNPK (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K)を見いだした。そこで、HNRNPKをノックダンするためのshort hairpin-RNAを発現するアデノウイルスを作製し、マウス胎児線維芽細胞（MEF）に感染させて後にRNAあるいはタンパク質を回収した後に熱ストレス誘導性のHSP70発現を調べた。詳細な実験によりHNRNPKをノックダウンすると熱ショック条件下でHSP70の発現が上昇、あるいは条件によっては低下することを明らかにした。しかし、ハウスキーピング遺伝子であるβアクチン遺伝子の発現も顕著に低下しており、HNRNPKは遺伝子発現に関与しているがその作用はHSP70あるいは熱ショック応答に特異的ではないと結論づけた。したがってHNRNPKのクロマチンへの影響の実験を進めないこととした。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

おおよそ予定していた実験を行い、予想外ではあるがHNRNPKの熱ショック応答における役割と機能について一定の結論を得ることができた。

今後の研究の推進方策

これまでに、細胞質を含む細胞のタンパク質毒性ストレスはHSF1-SSBP1を介して細胞質とミトコンドリアのシャペロンを誘導することを示してきた。今後は、ミトコンドリアに特異的なタンパク質毒性ストレス条件下でのシャペロン群の誘導を明らかにし、それらの誘導がHSF1-SSBP1に依存しているかどうかを明らかにする。さらに、SSBP1と相互作用しないHSF1-K188Aを発現するマウスを作製することで、HSF1-SSBP1の老化や神経変性疾患での生理的意義を明らかにする。
（１）HSF1-SSBP1とミトコンドリア特異的ストレスの解析
ミトコンドリア特異的にタンパク質毒性ストレスを誘導することが知られている薬剤で処理した際のミトコンドリアHSP60および細胞質HSP70の誘導を調べる。HSF1+/+とHSF1-/-、あるいはHSF1とSSBP1のノックダウンMEF細胞を用いてこれらのHSPの発現を比較することでHSF1およびSSBP1の寄与を明らかにする。また、ミトコンドリアHSP90あるいはミトコンドリアHSP70のノックダウン条件下でのこれらHSPの誘導を調べる。さらに、ミトコンドリア特異的なタンパク質毒性ストレス条件下で、ミトコンドリアの酸素消費率、ATP産生、膜電位をはじめとするミトコンドリア機能の維持にHSF1-SSBP1が貢献することを明らかにする。
（２）HSF1-SSBP1のマウスにおける生理機能の解析
一方、HSF1-SSBP1の老化や神経変性疾患での生理的意義を明らかにするために、CRISPR/CAS9システムを用いてSSBP1と相互作用しないHSF1-K188Aを発現するマウスを作製する。このマウスの脳、筋肉系等の異常およびミトコンドリア機能を週齢ごとに調べることで、生理的条件下でのHSF1-SSBP1の役割を明らかにする。

研究成果

• [雑誌論文] Long-term melatonin treatment delays ovarian aging. (2017)
  • 著者名/発表者名: Tamura H, Kawamoto M, Sato S, Tamura I, Maekawa R, Taketani T, Aasada H, Takaki E, Nakai A, Reiter RJ, Sugino N.
  • 雑誌名: Journal of Pineal Research 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1111/jpi.12381
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Anti-TNF-α agent infliximab and splenectomy are protective against renal ischemia-reperfusion injury. (2016)
  • 著者名/発表者名: Y. Nagata, M. Fujimoto, K. Nakamura, N. Isoyama, M. Matsumura, K. Fujikawa, K. Uchiyama, E. Takaki, R. Takii, A. Nakai, and H. Matsuyama.
  • 雑誌名: Transplantation 巻: 100 ページ: 1675-1682
  • DOI: 10.1097/TP.0000000000001222.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Heat shock transcription factor 1-associated expression of slow myosin heavy chain in mouse soleus muscle in response to unloading with or without reloading. (2016)
  • 著者名/発表者名: S. Yokoyama, Y. Ohno, T. Egawa, K. Yasuhara, A. Nakai, T. Sugiura, Y. Ohira, T. Yoshioka, M. Okita, T. Origuchi, and K. Goto.
  • 雑誌名: Acta Physiologica 巻: 217 ページ: 325-337
  • DOI: 10.1111/apha.12692
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Characterization of the novel mutant A78T-HERG from a long QT syndrome type 2 patient: Instability of the mutant protein and stabilization by heat shock factor 1. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kondo T., Hisatome I., Yoshimura S., Mahati E., Notsu T., Li P., Iitsuka K., Kato M., Ogura K., Miake J., Aiba T., Shimizu W., Kurata Y., Sakata S., Nakasone N., Ninomiya H., Nakai A., Higaki K., Kawata Y., Shirayoshi Y., Yoshida A., Yamamoto K.
  • 雑誌名: Journal of Arrhythmia 巻: 32 ページ: 433-440
  • DOI: 10.1016/j.joa.2015.10.005
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] M3 muscarinic receptor signaling stabilizes a novel mutant human ether-a-go-go-related gene channel protein via phosphorylation of heat shock factor 1 in transfected cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: Mahati E., Li P., Kurata Y., Maharani N., Nobuhito I., Sakata S., Ogura K., Miake J., Aiba T., Shimizu W., Nakasone N., Ninomiya H., Higaki K., Yamamoto K., Nakai A., Shirayoshi Y., Hisatome I.
  • 雑誌名: Circulation Journal 巻: 80 ページ: 2443-2452
  • DOI: 10.1253/circj.CJ-16-0712
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A study of hearing function and histopathologic changes in the cochlea of the type 2 diabetes model Tsumura Suzuki obese diabetes mouse. (2016)
  • 著者名/発表者名: Tsuda J, Sugahara K, Hori T, Kanagawa E, Takaki E, Fujimoto M, Nakai A, Yamashita H.
  • 雑誌名: Acta Otolaryngology 巻: 136 ページ: 1097-1106
  • DOI: 10.1080/00016489.2016.1195012
  • 査読あり
• [学会発表] HSF1転写複合体解析による熱ショック応答機構の解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 瀧井良祐、藤本充章、Arpit Katiyar、松本雅記、中井 彰
  • 学会等名: 冬の若手ワークショップ2017
  • 発表場所: 一宮シーサイドオーツカ（千葉県・長生郡）
  • 年月日: 2017-01-30 – 2017-02-01
• [学会発表] HSF1転写複合体の同定と機能解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 瀧井良祐、藤本充章、Arpit Katiyar、松本雅記、中井 彰
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県・横浜市）
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [学会発表] HSF1 is a common regulator of cytoplasmic and mitochondria-specific proteotoxic stress responses in mammals. (2016)
  • 著者名/発表者名: Arpit Katiyar, Mitsuaki Fujimoto, Ryosuke Takii, and Akira Nakai.
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県・横浜市）
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [学会発表] Anti-TNFa agent Infliximab and splenectomy are protective against renal ischemia-reperfusion injury. (2016)
  • 著者名/発表者名: 永田雄大、磯山直仁、内山浩一、中井 彰、松山豪泰
  • 学会等名: 第68回西日本泌尿器科学会総会
  • 発表場所: 海峡メッセ下関（山口県・下関市）
  • 年月日: 2016-11-24 – 2016-11-27
• [学会発表] 熱ショック応答におけるポリADPリボシル化酵素の役割 (2016)
  • 著者名/発表者名: 藤本 充章、瀧井良祐、Arpit Katiyar、中井 彰
  • 学会等名: 第11回臨床ストレス応答学会大会
  • 発表場所: 山口大学（山口県・宇部市）
  • 年月日: 2016-11-11 – 2016-11-12
  • 招待講演
• [学会発表] HSF1 is a regulator of mitochondrial HSP genes in mammals. (2016)
  • 著者名/発表者名: Arpit Katiyar, Mitsuaki Fujimoto, Ryosuke Takii, Ke Tan, and Akira Nakai.
  • 学会等名: 第11回臨床ストレス応答学会大会
  • 発表場所: 山口大学（山口県・宇部市）
  • 年月日: 2016-11-11 – 2016-11-12
• [学会発表] マウスLeydig細胞でのステロイド合成におけるHSF1の役割 (2016)
  • 著者名/発表者名: 岡 真太郎、白石弘司、藤本充章、Arpit Katiyar、瀧井良祐、中井 彰、松山豪泰
  • 学会等名: 第11回臨床ストレス応答学会大会
  • 発表場所: 山口大学（山口県・宇部市）
  • 年月日: 2016-11-11 – 2016-11-12
• [学会発表] HSF1-SSBP1 complex maintains mitochondrial function via upregulation of NRF1 expression during heat shock. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ke Tan, Yumei Fan, Arpit Katiyar, Mitsuaki Fujimoto, Ryosuke Takii, Akira Nakai, and Xianglin Duan.
  • 学会等名: 第11回臨床ストレス応答学会大会
  • 発表場所: 山口大学（山口県・宇部市）
  • 年月日: 2016-11-11 – 2016-11-12
• [学会発表] Regulation of proteostasis and the heat shock response. (2016)
  • 著者名/発表者名: Akira Nakai
  • 学会等名: College of Life Science, Hebei Normal University
  • 発表場所: Shijiazhuang, China
  • 年月日: 2016-10-27 – 2016-10-27
  • 招待講演
• [学会発表] HSF1転写複合体による細胞の恒常性維持機構 (2016)
  • 著者名/発表者名: 中井 彰
  • 学会等名: 第89回日本生化学会大会
  • 発表場所: 仙台国際センター（宮城県・仙台市））
  • 年月日: 2016-09-25 – 2016-09-27
  • 招待講演
• [学会発表] 進化的アプローチによる熱ショック因子HSF1転写複合体の同定 (2016)
  • 著者名/発表者名: 瀧井良祐、藤本充章、高木栄一、Arpit Katiyar、松本雅記、中井 彰
  • 学会等名: 第89回日本生化学会大会
  • 発表場所: 仙台国際センター（宮城県・仙台市）
  • 年月日: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [学会発表] HSF1-PARP複合体はDNA損傷応答に関与する (2016)
  • 著者名/発表者名: 藤本充章、瀧井良祐、高木栄一、Arpit Katiyar、中井 彰
  • 学会等名: 第89回日本生化学会大会
  • 発表場所: 仙台国際センター（宮城県・仙台市）
  • 年月日: 2016-09-25 – 2016-09-25
• [学会発表] 熱ショック応答によるミトコンドリアのプロテオスタシス制御 (2016)
  • 著者名/発表者名: 中井 彰
  • 学会等名: 第12回レドックス・ライフイノベーションシンポジウム
  • 発表場所: 熊本大学（熊本県・熊本市）
  • 年月日: 2016-08-18 – 2016-08-19
  • 招待講演
• [備考] 山口大学大学院医学系研究科 医化学講座
  • URL: http://ds22.cc.yamaguchi-u.ac.jp/~seika2/