| 研究課題/領域番号 |
15H04756
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
中村 昭則 信州大学, 医学部附属病院, 教授(特定雇用) (10303471)
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| 研究分担者 |
武田 伸一 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所 遺伝子疾患治療研究部, 部長 (90171644)
柴 祐司 信州大学, 医学部附属病院, 講師(特定雇用) (70613503)
宮崎 大吾 信州大学, 医学部附属病院, 講師(特定雇用) (80596370)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 筋ジストロフィー / DMD遺伝子 / iPS細胞 / エクソンスキップ治療 / 網羅的遺伝子発現解析 |
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| 研究実績の概要 |
Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）は、DMD遺伝子変異によりジストロフィンが欠損して発症する致死性筋疾患である。近年、DMDにおける変異によって生じたアミノ酸の読み枠を修正するエクソン・スキップ治療法の開発と臨床応用が期待されている。
我々は、これまでにまた、エクソン45～55を欠失した患者の骨格筋症状が極めて軽微であることを報告し、さらにエクソン45～55にDMD遺伝子変異の60%以上が集積していることから、エクソン45‐55スキップ治療がDMDに対して極めて有効な治療となり得る可能性について、モデル動物を用いて実証してきた。
本研究では、DMD患者iPS細胞を用いて、（1）エクソン46‐55欠失DMD患者の末梢血リンパ球からiPS細胞を樹立し、（2）iPS細胞より分化させた心筋および骨格筋細胞に対し人工核酸アンチセンス薬によりエクソン45スキップを誘導を行い、（3）エクソン45スキップの有効性と安全性の検討と、分子生物学的に検討することを目的とする。
平成27年度は（1）について、患者および健常者の末梢血リンパ球からiPS細胞を作成し、心筋細胞への分化に成功した。さらに、両細胞について網羅的遺伝子発現解析を行い、検討を行った。多数の遺伝子の発現に差異が認められ、定量的PCRおよびウエスタンブロットで確認を行った。これらの中には、機能が十分には知られていない遺伝子が多く含まれていた。
そこで、これらの遺伝子についてエクソン45スキップ治療後にどのように発現が変化しうるか、またその遺伝子の機能についても検討を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成27年度では、エクソン46‐55欠失変異を持つDMD患者の末梢血リンパ球からiPS細胞を作成樹立に成功した。申請時当初は、患者の皮膚繊維芽細胞を用いて、iPS細胞を樹立する予定であったが、採取に侵襲性の少ない採血により得た末梢血リンパ球からの誘導に成功した。
さらに、iPS細胞から心筋細胞への分化誘導に成功し、現在、iPS由来正常心筋細胞と合わせてマイクロアレイを用いて網羅的遺伝子発現解析を行った。
現在、両細胞間における遺伝子発現差異のある遺伝子について定量的PCR法およびウエスタンブロット法で遺伝子発現の検証を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度の研究実施計画は以下を予定している。
①iPS細胞から骨格筋細胞への分化誘導：iPS細胞に対し、MyoD1遺伝子を導入して骨格筋細胞への分化誘導を行う。続いて、心筋細胞と同様にエクソン46‐55欠失DMD患者骨格筋細胞と正常骨格筋細胞に対しジストロフィンの発現と網羅的遺伝子発現解析を行う。
②エクソン46‐55欠失iPS細胞由来の心筋、骨格筋細胞に対するアンチセンス薬によるエクソン45スキップ：分化誘導したエクソン46‐55欠失DMD患者のiPS細胞由来の骨格筋、心筋、平滑筋の各細胞に対してエクソン45を標的としたアンチセンス薬を用いてエクソン 45スキップを行う。これによりmRNA前駆体からmRNAが形成されるスプライシングの過程でエクソン45‐55欠失に変換され、アミノ酸の読み枠のずれ（アウト・オブ・フレーム）が修正（イン・フレーム）されて、ジストロフィンの発現が回復すると予測される。
そこで、アンチセンス薬によりエクソン45スキップ誘導を受けた心筋、骨格筋細胞においてジストロフィンの発現が回復するか、誘導を行わなかった患者細胞および正常細胞との間の量的な差についての検討を行う。また、エクソン45スキップ誘導により影響を受ける他の遺伝子について、マイクロアレイを用いて網羅的遺伝子発現解析を行う。
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