| 研究課題/領域番号 |
15H04766
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
八坂 敏一 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 准教授 (20568365)
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| 研究分担者 |
村田 祐造 佐賀大学, 医学部, 准教授 (20128143)
原 博満 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (20392079)
吉田 裕樹 佐賀大学, 医学部, 教授 (40260715)
山崎 晶 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (40312946)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 疼痛学 / 神経免疫連関 / 脳内炎症 / パターン認識受容体 / 神経障害性痛 |
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| 研究実績の概要 |
神経障害性疼痛は難治性の慢性疼痛であり通常の鎮痛薬が奏効しないため発症メカニズムの解明と有効な治療薬の開発が望まれている。末梢神経の障害がトリガーとなり様々な連鎖反応が起きて痛みが慢性化すると考えられている。この過程にパターン認識受容体のトル様受容体が関与していることは既に報告されているが、我々は異なるタイプのパターン認識受容体であるITAM（Immunoreceptor tyrosine-based activation motif）受容体も重要と考え研究を行っている。これらの受容体は、損傷自己を認識するものもあることから、神経損傷により活性化する可能性があると考えられる。
本研究ではITAM受容体の内、C型レクチン受容体X（CLRX）を主なターゲットとして研究を行っている。これまでにCLRXのKOマウスでは神経障害性疼痛が起こらないこと、神経損傷後のこの分子のmRNA発現は、神経切断部位で著しい増加を認めたことを報告した。この結果から神経切断部位に浸潤してくる細胞にCLRXが発現しており、CLRX依存的なシグナルが後根神経節細胞の活動や遺伝子発現を変化させ、脊髄に投射している終末から脊髄後角に影響を与えていることが示唆された。
今年度はこれらの細胞を同定することや、内因性のリガンドの検索などを行った。切断された神経の断端付近をヘマトキシリン染色で観察した結果分葉化した核を持った細胞が多数観察された。この形態から好中球が主な浸潤細胞と考えられた。神経系に内因性リガンドとなり得る物質が含まれているのかどうかを検討するため、脳・脊髄・末梢神経を採取しそれぞれから脂溶性の各分と水溶性の各分を抽出した。リガンド刺激によってGFPを発現するレポーター細胞を、これらの抽出物で刺激を行った結果、末梢神経でのみ反応が見られた。しかし、結果が安定しておらず、さらなる検討が必要である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究ではダメージを受けた細胞から放出される因子（damage associated molecular patterns, DAMPs）がITAM受容体を刺激することを仮説として本研究をスタートさせた。末梢神経を損傷した場合、その特殊な構造のため、DAMPsが放出される可能性がある部位は一つとは限られず、切断部位、切断された末梢神経の細胞体である後根神経節、脊髄に投射している終末部等が考えられる。これまでにCLRXのmRNAが切断部位において切断後早い時間経過で上昇することが分かったため、これらの細胞がどのような細胞なのかを同定する実験を行い、好中球の可能性が高いことが示唆された。
また、前年度CLRX KOマウスと野生型マウスについて神経損傷後の脊髄および切断部位からRNAを抽出しマイクロアレイ解析を行った。パスウェイ解析などを行ったが、解釈の難しいデータであった。そのため、神経障害性疼痛に関与する遺伝子として過去の文献に報告されている遺伝子について検討を行った。しかし、それらの中にも大きな差が生じるものはほとんどなかった。この実験はまだ継続中であり、サンプル数を増やしたり、他の遺伝子について調べたりして、遺伝子発現に変化の解析を行う。
また、脊髄のミクログリアの動態についても検討を行っており、神経損傷後増殖したミクログリアを形態学的に観察している中で、ニューロンとの物理的相互作用があるような像が得られた。今後この現象について検討していく必要がある。また、アダプター分子Yについては、アメリカのグループが神経障害性疼痛モデルにおけるこの分子について論文発表したため、現在は休止している。
本年度は研究代表者の異動があったため、実験機器を含めた研究環境の変化がおこった。そのため、備品として除振台を購入した。また、移動先での動物実験などのセットアップに時間を要した。
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| 今後の研究の推進方策 |
CLRXに関しては内因性のリガンド検索を引き続き行う必要がある。当初術後の末梢神経切断部位を採取して、その組織中にCLRXのリガンドが存在するかどうかについて調べる予定であったが、リガンドの性質としてもともと組織中に含まれる可能性が高いと考えられるため、手術を行わずに組織から抽出を行うこととした。脊髄神経1本を切断した場合にその切断部位から得られる収量はわずかであり、組織をそのまま用いることで効率化を図ることができると期待される。この抽出物によりレポーター細胞を刺激して検索する。
また、CLRXのmRNA上昇が切断部位に顕著であり、その時間経過と伴って好中球様の分葉化した核を持つ細胞が集簇していることが分かった。この細胞についてマーカーを用いるなど他の方法（フローサイトメーターや免疫組織化学染色やin situハイブリダイゼーション法）を用いて同定する。さらに、主な浸潤細胞である好中球やマクロファージを選択的に取り除く処置や野生型マウスとKOマウス間で骨髄移植を行い、実際に骨髄系細胞が責任細胞であるのかを同定する。また、これまで神経障害性疼痛に関すると報告されている遺伝子についても切断部位、後根神経節、脊髄において検討する。
神経切断後に脊髄で増殖したミクログリアについて、神経細胞との物理的相互作用について検証する。
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