組織再構築転写因子KLFのin vivo蛋白複合体の解析とその阻害物質の探索

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15H04824
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 永井 良三 自治医科大学, 医学部, 学長 (60207975)
• 研究分担者: 相澤 健一 自治医科大学, 医学部, 准教授 (70436484) ; 仲矢 丈雄 自治医科大学, 医学部, 講師 (80512277)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: KLF5 / KLF5阻害薬 / 心血管リモデリング / 大腸癌 / 心‐脳‐腎臓器連関

研究実績の概要

我々は転写因子KLF5が心血管系リモデリング、癌の病態等に重要であることを解明してきた。特に間葉系細胞でのKLF5活性化は心肥大や臓器線維化の重要要因である。一方、KLF5は負荷に対する恒常性維持に関わる。我々は、腎集合管特異的KLF5欠損マウスを手掛かりに、心-脳-腎の臓器連関を解明し，最近、報告した(Nat. Med., 2017)。
これらの成果に基づき、KLF5の機能を制御する薬は、心血管リモデリングや癌の病態を改善すると期待される。しかしKLF5は生体恒常性も担うため、開発すべき薬剤は正常細胞を傷害せず病的細胞のみを選択的に抑制することが求められる。
本研究においてKLF5の活性を抑制する化合物を探索した。その結果、培養大腸癌細胞をほぼ死滅させるのに対し、正常大腸細胞に傷害を与えない低分子化合物を見出した。また、本化合物は活性化平滑筋細胞の増殖も抑制し、KLF5とTCF4の蛋白分解を促進した。さらに、化合物化学構造と細胞増殖抑制能の間に構造活性相関があることも解明した。
しかし本化合物群がどの蛋白と結合し作用するか、結合蛋白とKLF5との蛋白間相互作用阻害がなぜ病態の選択的抑制につながるのかは不明である。今後これを明らかにし、KLF5蛋白複合体の観点から病態制御の分子機構解明を進める予定である。また本化合物を大量合成しin vivoでの病態抑制能の解析を行い、化学構造を改良しより心血管系や癌の病態を効果的に改善する薬剤開発を進める。
心血管リモデリングや癌の発症に関わる遺伝子群と分子機構は解明が進んでいる。これに対し、生体恒常性維持におけるこれら因子の機能を抑制せず、病態促進機能のみを選択的に抑制する方法の開発は進んでいない。本研究では今後、in vivoで正常細胞を傷害せず心肥大や動脈硬化などの心血管リモデリングと癌細胞の増殖を選択的に抑制する治療薬開発を進める。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

我々は、KLF5の病態制御の分子機構を解明する研究を長年進めてきた。最近、マウスで腎臓集合管特異的にKLF5を欠損させたマウスの心臓に圧負荷を加えると、心機能の低下を生ずることを見出した。これを手掛かりに、心臓への圧負荷が自律神経系を介して腎集合管細胞および腎血管内皮細胞からCSF2を産生させ、これが心筋内に抗炎症性M2マクロファージを動員すること、M2マクロファージはEGFファミリーのamphiregulinを産生することにより、負荷に対する心臓の適応を促すこと、すなわちKLFが心臓-脳-腎臓をつなぐ新しい負荷適応のシステムであることを解明し報告した(Nat. Med., 2017)。これらの成果をもとに、我々はKLFの正常機能をできるだけ抑制せず、疾患で活性化された細胞選択的に作用する化合物の開発を進めている。
KLF5は、特定の立体構造をとらない天然変性蛋白であり、DNAと結合するZnフィンガー領域以外は、結晶化が困難である。このため、KLF5の立体構造に基づく阻害薬の開発は困難である。この課題を今回、in silicoの方法を駆使してKLF5の阻害作用を有する新規低分子化合物群を見出した。興味深いことに、これらのKLF5阻害薬は、正常大腸細胞を抑制せずに、培養大腸癌細胞のみを選択的に抑制する。また、KLF5阻害薬は、大腸癌細胞におけるKLF5、TCF4、Survivin等の蛋白量を抑制するが、正常大腸細胞ではこれらを抑制しない。さらに、同阻害薬は活性化された血管平滑筋細胞(C2/2細胞、我々がKLF5を単離した細胞)の増殖も抑制することが明らかとなった。これらの成果は、KLF5阻害薬が、心血管リモデリングや癌に有効な薬剤となる可能性を示す。このように、本研究では心血管病態と癌の分子機構解明から創薬まで一貫し研究を展開しており、今後の発展が期待できる。

今後の研究の推進方策

本研究において我々は転写因子KLF5の多彩な作用を明らかにするために、活性化平滑筋細胞および癌細胞におけるKLF5の転写複合体解析とこれを阻害する薬剤の開発を進めている。既に我々は形質転換した平滑筋細胞と癌細胞の増殖を抑制するKLF5阻害化合物群を見出した。しかしながら本化合物群がどのようなメカニズムで活性化細胞の増殖を抑制するのか、その分子機構の解明は進んでいない。また、心血管病態のin vivoモデルにおける薬剤の有効性についても検討が残されている。さらに化学構造の改良によってどこまで作用を高めることができるかも残された課題である。
これらの状況を踏まえ、以下の方針で今後の研究を進める。
(1)活性化平滑筋細胞（C2/2細胞）における KLF5転写複合体の解析と、KLF5阻害化合物の作用機構の解明： 我々がKLF5を単離したC2/2細胞において、KLF5が形成する転写複合体を、レトロウィルスに組み込んだタグ付KLF5を用いて明らかにする。またKLF5阻害化合物がKLF5の転写複合体に及ぼす効果も明らかにする。 まずは過去に我々が明らかにした結合蛋白を解析し、さらにタグ付KLF5に結合する蛋白についてプロテオミクス技術により検討する。(2) KLF5阻害化合物のin vivoにおける心血管リモデリング抑制効果の評価： KLF5阻害化合物を大量に合成し、in vivoにおける心血管系リモデリング抑制効果を評価する。モデルは圧負荷心肥大動物を用いる。(3) KLF5の癌細胞抑制作用の検討：KLF5は肺癌細胞で大量に発現することが知られている。そこで肺癌細胞を中心に、KLF5阻害化合物の癌細胞に対する増殖抑制効果をin vivoおよびin vitroで評価する。(4) これらの検討を進めつつ、KLF5阻害化合物のin vivoにおける薬物動態の解明、化合物の化学構造の改良を行う。

研究成果

• [雑誌論文] A heart-brain-kidney network controls adaptation to cardiac stress through tissue macrophage activation. (2017)
  • 著者名/発表者名: Fujiu K, Shibata M, Nakayama Y, Ogata F, Matsumoto S, Noshita K, Iwami S, Nakae S, Komuro I, Nagai R, Manabe I
  • 雑誌名: Nature Medicine 巻: 23 ページ: 611-622
  • DOI: 10.1038/nm.4326
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Identification of M2 macrophages in anterior pituitary glands of normal rats and rats with estrogen-induced prolactinoma. (2017)
  • 著者名/発表者名: Fujiwara K, Yatabe M, Tofrizal A, Jindatip D, Yashiro T, Nagai R.
  • 雑誌名: Cell and Tissue Research 巻: 368 ページ: 371-378
  • DOI: 10.1007/s00441-016-2564-x
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Islet inflammation in type 2 diabetes and physiology. (2017)
  • 著者名/発表者名: Eguchi K, Nagai R.
  • 雑誌名: Journal of Clinical Investigation 巻: 127 ページ: 14-23
  • DOI: 10.1172/JCI88877
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] KLF15 Enables Rapid Switching between Lipogenesis and Gluconeogenesis during Fasting. (2016)
  • 著者名/発表者名: Takeuchi Y, Yahagi N, Aita Y, Murayama Y, Sawada Y, Piao X, Toya N, Oya Y, Shikama A, Takarada A, Masuda Y, Nishi M, Kubota M, Izumida Y, Yamamoto T, Sekiya M, Matsuzaka T, Nakagawa Y, Urayama O, Kawakami Y, Iizuka Y, Gotoda T, Itaka K, Kataoka K, Nagai R, Kadowaki T, Yamada N, Lu Y, Jain MK, Shimano H.
  • 雑誌名: Cell Reports 巻: 16 ページ: 2373-86
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2016.07.069
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Choroidal Neovascularization Is Inhibited in Splenic-Denervated or Splenectomized Mice with a Concomitant Decrease in Intraocular Macrophage. (2016)
  • 著者名/発表者名: Tan X, Fujiu K, Manabe I, Nishida J, Yamagishi R, Terashima Y, Matsushima K, Kaburaki T, Nagai R, Yanagi Y.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 11 ページ: e0160985
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0160985
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Association between the docosahexaenoic acid to arachidonic acid ratio and acute coronary syndrome: a multicenter observational study. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nishizaki Y, Shimada K, Tani S, Ogawa T, Ando J, Takahashi M, Yamamoto M, Shinozaki T, Miyazaki T, Miyauchi K, Nagao K, Hirayama A, Yoshimura M, Komuro I, Nagai R, Daida H.
  • 雑誌名: BMC Cardiovascular Disorders 巻: 16 ページ: 143
  • DOI: 10.1186/s12872-016-0299-y
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Influence of periostin-positive cell-specific Klf5 deletion on aortic thickening in DOCA-salt hypertensive mice. (2016)
  • 著者名/発表者名: Zempo H, Suzuki JI, Ogawa M, Watanabe R, Fujiu K, Manabe I, Conway SJ, Taniyama Y, Morishita R, Hirata Y, Isobe M, Nagai R.
  • 雑誌名: Hypertension Research 巻: 39 ページ: 764-768
  • DOI: 10.1038/hr.2016.65
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] HIF-1α-PDK1 axis-induced active glycolysis plays an essential role in macrophage migratory capacity. (2016)
  • 著者名/発表者名: Semba H, Takeda N, Isagawa T, Sugiura Y, Honda K, Wake M, Miyazawa H, Yamaguchi Y, Miura M, Jenkins DM, Choi H, Kim JW, Asagiri M, Cowburn AS, Abe H, Soma K, Koyama K, Katoh M, Sayama K, Goda N, Johnson RS, Manabe I, Nagai R, Komuro I.
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 7 ページ: 11635
  • DOI: 10.1038/ncomms11635
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Excess Lymphangiogenesis Cooperatively Induced by Macrophages and CD4(+) T Cells Drives the Pathogenesis of Lymphedema. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ogata F, Fujiu K, Matsumoto S, Nakayama Y, Shibata M, Oike Y, Koshima I, Watabe T, Nagai R, Manabe I.
  • 雑誌名: Journal of Investigative Dermatology 巻: 136 ページ: 706-714
  • DOI: 10.1016/j.jid.2015.12.001
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Ataxia telangiectasia mutated in cardiac fibroblasts regulates doxorubicin-induced cardiotoxicity. (2016)
  • 著者名/発表者名: Zhan H, Aizawa K, Sun J, Tomida S, Otsu K, Conway SJ, Mckinnon PJ, Manabe I, Komuro I, Miyagawa K, Nagai R, Suzuki T.
  • 雑誌名: Cardiovascular Research 巻: 110 ページ: 85-95
  • DOI: 10.1093/cvr/cvw032
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [学会発表] Small molecular mimicries of KLF5 selectively suppress the survival and Wnt-KLF5 signaling of colorectal cancer cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: 仲矢丈雄、中野洋文、河西政次、吉森篤史、田中亨、小路弘行、永井良三
  • 学会等名: 日本癌学会
  • 発表場所: パシフィコ横浜 (横浜、神奈川)
  • 年月日: 2016-10-06 – 2016-10-08
• [学会発表] Future Directions for KLF Research (2016)
  • 著者名/発表者名: Ryozo Nagai
  • 学会等名: FASEB Science Research Conference “KLF and Sp Transcription Factors in Disease and Regenerative Medicine”
  • 発表場所: Snowmass Base Village Conference Center (Snowmass Village, CO, USA)
  • 年月日: 2016-08-07 – 2016-08-12
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] The protein interaction inhibitors of KLF5 suppress Wnt signalactivation selectively in colorectal cancer cells (2016)
  • 著者名/発表者名: Takeo Nakaya, Hirofumi Nakano, Masaji Kasai, Atsushi Yoshimori, Akira Tanaka, Hiroyuki Kouji, Ryozo Nagai
  • 学会等名: FASEB Science Research Conference “KLF and Sp Transcription Factors in Disease and Regenerative Medicine”
  • 発表場所: Snowmass Base Village Conference Center (Snowmass Village, CO, USA)
  • 年月日: 2016-08-07 – 2016-08-12
  • 国際学会