| 研究課題/領域番号 |
15H04829
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
中田 光 新潟大学, 医歯学総合病院, 教授 (80207802)
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| 研究分担者 |
坂上 拓郎 新潟大学, 医歯学系, 助教 (00444159)
田澤 立之 新潟大学, 医歯学総合病院, 准教授 (70301041)
牛木 隆志 新潟大学, 医歯学総合病院, 講師 (80579152)
北村 信隆 新潟大学, 医歯学総合病院, 教授 (90224972)
井上 義一 独立行政法人国立病院機構(近畿中央胸部疾患センター臨床研究センター), 臨床研究センター, 臨床研究センター長 (90240895)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 肺胞蛋白症 / 分子細胞呼吸器学 |
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| 研究実績の概要 |
自己免疫性肺胞蛋白症の血清抗GM-CSF自己抗体濃度は、低酸素血症を基準とした重症度と相関しないことが明らかとなっており、重症化には自己抗体の量ではなく、質が重要である。また、 健常者血清中にも微量ながら普遍的に存在し、その大半がGM-CSFと複合体を形成し、 IgG型ばかりでなく、IgM型、IgA型があるが、pathogenicなのは、IgG型であり、 患者IgG型自己抗体の軽鎖は、重症になるにつれてλ鎖が増加し、低下し、結果、κ/λ比は重症度と逆相関があることが明らかとなった。自己免疫性PAPの発症と重症化には、特定の配列を持ったIgG型クローンの選択的増殖が重要なのではないかと考え、様々な重症度の患者のIgG型GM-CSF自己抗体可変部のアミノ酸配列を次世代シークエンスにより求めた。B細胞を患者から分離し、ビオチン化GM-CSFを用いてGM-CSF自己抗体陽性細胞をソートし。RNA抽出を行いSMARTer system を使用しイムノグロブリンKappa or Lambda特異的プライマーを用いて増幅し、次世代シーケンスを行った。得られたシークエンスをIMGTを用いて解析したところ85.25%がイムノグロブリンLambda鎖の遺伝子が占めており(Fig2; k/l ratio; 0.185±0.125)、圧倒的なλドミナントの傾向を示した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
B細胞を13名の患者から分離、そこにビオチン化GM-CSFを反応させ、ストレプトアビジンでGM-CSFに反応した細胞のみを採取する。RNA抽出を行いSMARTer system を使用し、５’および３’端に特定の配列を付加して逆転写を行った後、患者ごとにID-tag配列をつけたイムノグロブリンKappa or Lambda特異的プライマーを用いて増幅し、それを次世代シーケンス用のアンプリコンとした。全180,756リードを結果として得られ、それに対してIMGTを用いて解析したところ146,351リードが抗体としての機能を持っている配列だった。(全12検体;中央値11,201.5 リード,レンジ3,457-27,939リードであった。そのうちの85.25%がイムノグロブリンLambda鎖の遺伝子が占めており( κ/λ ratio; 0.185±0.125)、圧倒的なドミナントの傾向を示した。また、λ鎖はκ鎖に比べて体細胞変異が多く発生していること、また、特定のクローンの選択増殖が起こっていることが示された。
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| 今後の研究の推進方策 |
27年度中にL鎖は、22人分 H鎖は32名分のPCRampliconを上記の方法で作成し、次世代シークエンス解析を実施した。
28年度は、このFasta形式のデータをバイオインフォマティクスツールIMGTにより解析し、超可変部位の配列の特徴を明らかにする。
予備的検討では、H鎖のCDR3は、特定の配列が使用されており、そこに対応するGM-CSF立体構造上の結合部位の推定が容易である。
また、L鎖では、特定のクローンの選択増殖が起こっていることが確認されている。頻度の高いH鎖、L鎖の組み合わせについて、GM-CSF分子の相互作用を抗体モデリングソフトを用いてエピトープの推定を行う。可能性があるいくつかのクローンの絞り込みができれば、CHO細胞に抗体分子を発現させ、できあがった抗体とGM-CSFの性状を解析していく。
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