研究課題
MDS、なかでも予後不良のRAEBに焦点を絞り、その根源的な病態である無効造血や骨髄系細胞の異型性が生じる分子メカニズムを解明する。当研究室は、RAEBの15%に認められ、しばしば単独の染色体異常である7番染色体長腕(7q)欠失の責任遺伝子単離を試みてきたが、最近、二つの論文に結実した。MikiとCG-NAPは、分裂期における中心体成熟に必須の蛋白質である。その欠失は分裂前中期の著明な延長をもたらし、7q-を伴うRAEBの核形態異常と染色体不安定性の原因と見られる（Mol. Cell 2012）。Samd9とSamd9Lは、初期エンドソームに局在する関連蛋白質で、その欠失はエンドソームどうしの融合を抑制し、リガンド結合サイトカイン受容体の代謝を遅延させてサイトカインシグナルの増強をもたらし、MDSを発症させる(Cancer Cell 2014)。いずれも片アレル欠失不全(haploinsufficiency)でMDSを発症させると考えられる。本研究計画では、これらの遺伝子の機能解析研究の過程で見出した、新たなMDS原因候補遺伝子群や実験系を解析し、①MDS細胞における細胞骨格シグナル異常の解析、②中心体成熟不全による染色体不安定性惹起メカニズムの解明の研究を特段に推進する。
2: おおむね順調に進展している
Samd9LのMDS発症機序の分子細胞生物学的検討では、アクチンリモデリングへの影響を検討するため、wound healing assayを行った。線維芽細胞などの付着細胞を培養皿いっぱいに培養し、イエローチップの先端などで傷を付け、傷周辺の細胞が遊走して間隙が埋まる様子を観察する、簡便かつ再現性の高い遊走能試験である。通常、細胞は申し合わせたように「まっしぐら」に遊走して効率よくギャップが埋まるのに比較して、Samd9L+/-細胞は、遊走速度は変わらないものの、遊走方向が定まらないことを見出した。ところが、ファロイジン染色でアクチンのストレスファイバーを観察しても、その形成には確たる異常が見られないことから、Samd9Lは遊走方向のコントロールを行うことが推察された。これまでアクセルに相当する遊走速度の低下は色々な遺伝子の欠損で認められているが、ハンドルに当たる遊走方向の制御に関する知見は乏しく、本研究は細胞遊走研究のブレークスルーになる可能性がある。一方、Miki欠損によるMDS特有の核形態異常や染色体不安定性制御メカニズムに関して検討するため、ヒストンH2A-GFP融合タンパク質をHeLa細胞に発現させ、動画撮影（コマ落ち撮影）で、そのメカニズムの詳細を検討した。その結果、分列前中期の延長から紡錘糸チェックポイントの遷延によるアポトーシスの進行過程で、凝縮に向かうはずのクロマチンが何らかの機序により一転して間期核の方向である脱凝縮に向かい、不規則な多核細胞として分裂を異常終了する、いわゆるスリッページ現象を起こすことが判明した。
これらの所見を糸口に、①ではSamd9/Samd9Lが細胞遊走で果たす機能を解析する。具体的には定法に基づいて、EEA1やRab5、Samd9/Samd9L抗体による免疫沈降産物を、質量解析器により分析し、これらの蛋白質の変異体を随時用いて、Samd9/Samd9LのEEA1/Rab5複合体内での結合状態の解明をおこなう。次に、Samd9/Samd9L欠損細胞や過剰発現細胞を用いて、Rho/Rac経路の重要因子の修飾状態を生化学的に分析し、Samd9/Samd9Lの生化学的な機能を解明する。また、Samd9L欠損マウスから発症したMDSの全エクソンシーケンス解析からRho guanine nucleotide exchange factor 7など3つの伝達因子の変異を同定しており（Cancer Cell 2014）、これらの因子の機能解析や点変異によるシグナル変化の同定を行って、MDSを発症させる細胞骨格シグナル伝達経路の異常を解明する。最終的なゴールとして、Samd9/Samd9Lが造血ニッチの中での造血細胞の振舞いに与える影響を、多光子励起顕微鏡を用いたアッセイ系を確立して解析することを試みたい。一方②では、Mikiの欠損がMDS特有の多核細胞を形成することが判明したため、造血細胞を用いたメカニズムの解明や症例での検討、すなわちMDS 芽球におけるMikiやCG-NAPの発現レベルと骨髄血標本中の分裂前中期や不規則多造血細胞の割合などのデータを揃え、論文作成に着手する。
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