| 研究課題/領域番号 |
15H04874
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
小池 健一 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (40143979)
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| 研究分担者 |
中沢 洋三 信州大学, 学術研究院医学系(医学部附属病院), 講師 (60397312)
重村 倫成 信州大学, 学術研究院医学系, 助教 (70623916)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | iPS細胞 / ゲノム修飾 / 先天性食細胞異常症 / 遺伝子治療 |
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| 研究実績の概要 |
CompoZrカスタムZFNを用いて該当遺伝子の変異部位特異的なZFNプラスミドの設計を行い、健常人由来細胞からゲノムDNA を抽出し、ZFN による切断部位挟んで上流・下流にそれぞれ800bp の領域をホモロジーアームとして、それを含む領域をサブクローニングした。次いで、両側のホモロジーアーム内に、mutagenesis 法を用いて2 か所ずつ塩基置換を行った。U937とA549細胞株を用いて、ヌクレオフェクション法によりeGFP配列を挿入したプラスミドを核内導入し、24時間後に蛍光が確認された。さらに、ドナープラスミドへピューロマイシン耐性遺伝子配列を挿入し、A549細胞のゲノムDNA上に遺伝子変異が適切に導入されることが確認できた。iPS細胞からCD34陽性CD45陽性の造血幹細胞を得るため、先天性食細胞異常症患者よりも細胞増殖能が高いと考えられる若年性骨髄単球性白血病患者の末梢血T細胞を用いた。若年性骨髄単球性白血病患者の末梢血T細胞にOct3/4, Sox2, Klf4, c-MycのcDNAをセンダイウイルスによりtransfectし、iPS細胞を作製した。次いで、iPSコロニーをAGM-S3 細胞上でBMP4、VEGF、SCF、TPOを同時に添加することにより、常に大量のCD34陽性CD45陽性CD38陰性細胞を得る培養方式を確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
該当遺伝子の変異部位特異的なZFNプラスミドの設計を行い、ZFN による切断部位挟んで上流・下流にそれぞれ800bp の領域をホモロジーアームとして、それを含む領域をサブクローニングし、両側のホモロジーアーム内に、mutagenesis 法を用いて2 か所ずつ塩基置換を行った。そして、ヌクレオフェクション法によりeGFP配列やピューロマイシン耐性遺伝子配列を挿入したプラスミドの核内導入が確認できた。
若年性骨髄単球性白血病患者の末梢血T細胞からiPS細胞を作製し、AGM-S3 細胞上でBMP4、VEGF、SCF、TPOを同時に添加することにより、常に大量のCD34陽性CD45陽性CD38陰性細胞を得る培養方式を確立できた。
これらの結果から、本研究課題はおおむね順調に進捗している。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度は以下の研究を遂行する。
１）iPS細胞は、MEF細胞上で集塊を作って増殖するが、ヌクレオフェクション法を用いて核内導入を行うためには、単細胞状態にしなければならない。そこで、単細胞化したiPS細胞へのZFN発現プラスミド、eGFPプラスミドの核内導入実験を行う。導入実験では、ヌクレオフェクションの条件や試薬の組み合わせを工夫しながら、増殖に影響せずに導入効率を保つ条件を検討する予定である。
２）平成27年度の研究成果を踏まえ、慢性肉芽腫症（CGD）患者の末梢血T細胞からiPS細胞を作製し、AGM細胞と共培養し、BMP4、VEGF、SCFやTPO等を添加し、CD34陽性細胞が産生される培養系を樹立する。産生されたCD34陽性細胞におけるCD45, CD38, CD33, c-kitなどの表面マーカーをフローサイトメトリーで解析するするとともに、メチルセルロース法によりコロニー形成能を検討する。
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