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Tet system制御ベクターとSlc26a4を標的としたshRNA(shRNA-pds)を組み込んだ応答ベクターが同一ベクターに搭載されたKnockout Single Vector Inducible RNAi System（Takara）を作製した。このTet systemベクターを胎生11.5日のマウス耳胞内に投与し、エレクトロポレーション法にて耳胞へ導入した（以下、shRNA発現誘導マウスモデルと記載）。このマウスに対して、①胎生11日から生後6日まで②胎生16日から生後6日までドキシサイクリンの投与を行い、コントロールにはドキシサイクリンの投与を行わない群を使用した。耳胞へのTet systemベクター導入後、胎生18.5日に帝王切開を行い、胎仔を出産させ、生後30日時点で聴覚機能評価（聴性脳幹反応検査）を評価した。ドキシサイクリンを投与しなかった群は難聴を発症しなかったが、ドキシサイクリンを投与した①②群では難聴を発症した（図1）。Slc26a4遺伝子が発現する期間は胎生16.5日から生後6日までであるため、その時期に遺伝子が発現しないことで難聴が発症することが考えられた。
また、申請者らの過去の報告（Miwa、Molecular Therapy 2013）と同様の方法を用いてCx30欠失マウス耳胞への正常Cx30遺伝子導入を行う前に正常マウス耳胞へeGFPを導入し。その後継時的に目的遺伝子の発現について免疫染色法、Western blot法にて確認した。
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