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光操作可能なシグナル分子やシグナル阻害分子を開発し、個体マウスに応用することが本研究の目的である。平成29年度は、植物のタンパク質であるPhototropin1のLOV2ドメインを利用して、遺伝子コード型光応答性キナーゼの開発を進めた。昨年度までに、神経細胞に発現するキナーゼについて、様々なリンカーでLOV2を融合し、さらにN末端とC末端にGFPとmCherryをそれぞれ融合したFRETセンサーを作製し、その光応答性を2光子蛍光寿命顕微鏡下で調べた。この方法により、光照射依存的に構造変化を起こす新規光応答性分子の開発に成功していた。今年度はこの分子のリン酸化能を調べるため、リン酸化抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った。具体的には、HeLa細胞または初代神経細胞に光応答性分子をコードする遺伝子を導入し、光照射の有無によってそれぞれサンプルを作製してリン酸化を検出した。その結果、光照射依存的に自己リン酸化を起こしていることを確認することができた。さらに、現在、光応答性分子をコードするアデノ随伴ウイルスを作製し、マウス大脳皮質において、光応答性分子の発現に成功している。今後は、2光子顕微鏡下で2光子励起によりシナプス長期増強が惹起できるかどうかを調べる予定である。
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