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2016 年度 実績報告書

新規時間分解計測法の開発とABCトランスポーターの分子機構解析への応用

研究課題

研究課題/領域番号 15H05476
研究機関神戸大学

研究代表者

木村 哲就  神戸大学, 理学研究科, 特命講師 (70506906)

研究期間 (年度) 2015-04-01 – 2018-03-31
キーワード時間分解計測 / ABCトランスポーター / マイクロ流路デバイス / 顕微分光測定
研究実績の概要

生体分子あるいはその分子部分が『連動・協奏・相互作用』することによって実現される高次機能の分子機構解明を目指している。対象として、ATPを利用して小分子を細胞膜の一方から他方へと輸送する膜タンパク質であるABCトランスポーターを選択し、その輸送・構造ダイナミクスを新規に開発する時間分解計測系によって観察し、①輸送を構成する化学反応の協約、②離合・集散を制御する分子間相互作用、③構造変化の連動性を明らかにする。本課題ではまず、①②に対応する以下の4種類の実験を行う。 1-1) ヘム輸送ダイナミクスを可視吸収分光計測、1-2) ATP結合/加水分解反応を赤外吸収分光計測、1-3) ABCトランスポーターのコンフォメーション変化を分子内FRET蛍光寿命計測、1-4) ABCトランスポートシステムの離合・集散ダイナミクスを分子間FRET蛍光寿命計測によって明らかにする。また、③に関しては 2) ケージドATPを用いたシリアルフェムト秒X戦結晶構造解析によって明らかにする。
1) に関して、平成27・28年度には分子拡散型マイクロ流路ミキサーの新規設計・作製を行い、1-1)に利用する顕微型可視吸収装置および1-3), 1-4) に利用する蛍光顕微鏡・蛍光寿命計測装置へ組み込み、その時間分解能の評価を行った。加えて、ヘムのABCトランスポーターであるBhuUV-Tの発現・精製系を構築し、BhuUVがヘムと結合したBhuTと特異的に結合すること、また加水分解に伴って結合型の形成が促進されることを見出した。1-2) についてはケージドNOをモデル系として行い、紫外レーザーの光照射によるケージド化合物の光解離反応によって気質が放出され反応を誘起することに成功した。2)に関しては光反応によって反応が誘起される膜タンパク質の時間分解X線結晶構造解析に成功し、複数の雑誌にその結果を報告した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

分子拡散型マイクロ流路ミキサーを用いた時間分解計測系の構築は順調に進んでいる。ミキサーの新規設計・作製を行い、顕微型可視吸収装置および蛍光顕微鏡・蛍光寿命計測装置へ組み込み、その時間分解能の評価を行った。
加えて、時間分解X線結晶構造解析を行うための光励起システムの構築を行い、複数のタンパク質へと適用した。さらにその発展系である、ケージド化合物による反応誘起にも成功している。ケージド化合物を用いた系はケージド化合物さえ安定に作成されれば、さらに多くのタンパク質へと適用可能になる。
また、研究対象であるABCトランスポーターに関してはその発現・精製系を構築に成功しており、膜貫通ドメインを持つトランスポーターに対して、輸送基質と結合したペリプラズムタンパク質とが特異的に結合することを可視吸収測定によって初めて明らかにし、加水分解に伴って結合型の形成が促進されることを見出した。

今後の研究の推進方策

平成29年度は平成28年度から立ち上げた装置の性能評価を金属膜タンパク質への基質配位反応およびその酵素反応の実時間観察によって評価する。
また、コンフォメーション変化や離合・集散ダイナミクスを捉えるためには、FRETに加えて、スピンラベルESRによる、アミノ酸残基間距離測定を行える系の立ち上げを開始する。FRETでは2箇所に部位特異的傾向標識を行う必要があるが、平成28年度にそのような標識を行うと収量が極端に低下することを見出したので、スピンラベルで2箇所を同時に同一のラベルを行うことで収量の向上が見込まれるためである。
ATPの結合/加水分解反応、および加水分解後のADPおよびリン酸の脱離はミリ秒から秒のオーダーで起こることがBhuUVのATP加水分解活性測定からわかってきた。これらの反応を赤外吸収分光法によってマイクロ流路中で観察するためには平成27年度に完成させたフェムト秒赤外レーザーを光源に用いた時間分解赤外吸収測定系よりも10 um近くの回折限界に近い空間分解能をもつ SPring-8の赤外放射光の顕微鏡が最適である。平成28年度より、そのためのマイクロ流路ミキサーの再設計を開始しており、平成29年度はその組み込みとABCトランスポーターへの適用を推進する。
同様に、時間分解X線結晶構造解析においては、結晶中へのATPの拡散を行う必要があり、現在のケージド化合物を用いた系だけでは10ms以降の遅延時間を測定することは容易ではない。そこで、マイクロ流路ミキサーを用いた新たな実験系の立ち上げを行い、微結晶を含んだ溶液と基質となる分子を含んだ溶液を混合し、反応開始後10ms以降の時間点での結晶構造解析を行えるようにする。

  • 研究成果

    (19件)

すべて 2017 2016 その他

すべて 国際共同研究 (6件) 雑誌論文 (4件) (うち国際共著 3件、 査読あり 3件、 謝辞記載あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (8件) (うち国際学会 2件、 招待講演 2件) 備考 (1件)

  • [国際共同研究] University of Grenoble Alpes/European Synchrotron Radiation Facility(France)

    • 国名
      フランス
    • 外国機関名
      University of Grenoble Alpes/European Synchrotron Radiation Facility
  • [国際共同研究] University of Gothenburg/Uppsala University(Sweden)

    • 国名
      スウェーデン
    • 外国機関名
      University of Gothenburg/Uppsala University
  • [国際共同研究] Pohang Univ. of Sci. and Tech.(韓国)

    • 国名
      韓国
    • 外国機関名
      Pohang Univ. of Sci. and Tech.
  • [国際共同研究] Paul Scherrer Institute/ETH Zurich(Switzerland)

    • 国名
      スイス
    • 外国機関名
      Paul Scherrer Institute/ETH Zurich
  • [国際共同研究] Freie University Berlin/Deutsches Elektronen-Synchrotron DESY/University of Hamburg(Germany)

    • 国名
      ドイツ
    • 外国機関名
      Freie University Berlin/Deutsches Elektronen-Synchrotron DESY/University of Hamburg
  • [国際共同研究]

    • 他の国数
      1
  • [雑誌論文] Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL2017

    • 著者名/発表者名
      Michihiro Suga, (他13名), Tetsunari Kimura, (他22名), Jian-ren Shen*
    • 雑誌名

      Nature

      巻: 543 ページ: 131-135

    • DOI

      10.1038/nature21400

    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin2016

    • 著者名/発表者名
      Eriko Nango, Antoine Royant, Minoru Kubo, Takanori Nakane, Cecilia Wickstrand, Tetsunari Kimura, (他37名), Richard Neutze*, So Iwata*
    • 雑誌名

      Science

      巻: 354 ページ: 1552-1557

    • DOI

      10.1126/science.aah3497

    • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography2016

    • 著者名/発表者名
      Przemyslaw Nogly, Valerie Panneels, Garrett Nelson, Cornelius Gati, Tetsunari Kimura, (他39名)
    • 雑誌名

      Nat. Commun.

      巻: 7 ページ: 12314

    • DOI

      10.1038/ncomms12314

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] A study of the dynamics of the heme pocket and C-helix in CooA upon CO dissociation using time-resolved visible and UV resonance Raman spectroscopy2016

    • 著者名/発表者名
      Akihiro Otomo, Haruto Ishikawa, Misao Mizuno, Tetsunari Kimura, Minoru Kubo, Yoshitsugu Shiro, Shigetoshi Aono, Yasuhiro Mizutani*
    • 雑誌名

      J. Phys. Chem. B

      巻: 120 ページ: 7836-7843

    • DOI

      10.1021/acs.jpcb.6b05634

  • [学会発表] ABCトランスポーターの機能・構造ダイナミクス(仮題)2017

    • 著者名/発表者名
      木村哲就
    • 学会等名
      第55回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      熊本大学(熊本市)
    • 年月日
      2017-09-19 – 2017-09-21
    • 招待講演
  • [学会発表] ABCトランスポーターの分子機構解明を目指した時間分解測定法の開発2017

    • 著者名/発表者名
      木村哲就、林沙英、大西萌、杉本宏、城宜嗣、小堀康弘、池本夕佳
    • 学会等名
      第43回生体分子科学討論会
    • 発表場所
      カレッジプラザ & IYATAKA(秋田市)
    • 年月日
      2017-06-23 – 2017-06-24
  • [学会発表] マイクロ流路ミキサーを用いた時間分解分光測定によるABCトランスポーターの輸送機構解析2017

    • 著者名/発表者名
      木村哲就、林沙英、大西萌、杉本宏、城宜嗣、小堀康弘、池本夕佳
    • 学会等名
      第17回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      仙台国際センター(仙台市)
    • 年月日
      2017-06-20 – 2017-06-22
  • [学会発表] 時間分解可視吸収分光測定によるヘムABCトランスポーターの輸送メカニズム解析2017

    • 著者名/発表者名
      林沙英、城宜嗣、杉本宏、木村哲就
    • 学会等名
      第17回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      仙台国際センター(仙台市)
    • 年月日
      2017-06-20 – 2017-06-22
  • [学会発表] Intermediate structures of the catalytic site in membrane proteins revealed by time-resolved spectroscopy with micro-channel devices.2016

    • 著者名/発表者名
      T. Kimura, H. Takeda, S. Ishii, T. Tosha, Y. Shiro, M. Kubo
    • 学会等名
      第54回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      つくば国際会議場(つくば市)
    • 年月日
      2016-11-25 – 2016-11-27
    • 招待講演
  • [学会発表] Structural dynamics in the enzymatic reaction of membrane protein; nitric oxide reductase, revealed by the novel time-resolved spectroscopic measurements.2016

    • 著者名/発表者名
      T. Kimura, H. Takeda, S. Ishii, T. Tosha, Y. Shiro, M. Kubo
    • 学会等名
      42nd Naito Conference "In the Vanguard of Structural Biology: Revolutionizing Life Sciences"
    • 発表場所
      シャトレーゼ ガトーキングダム サッポロ(北海道札幌市)
    • 年月日
      2016-10-04 – 2016-10-07
    • 国際学会
  • [学会発表] マイクロ流路フロー・フラッシュ時間分解赤外分光法による一酸化窒素還元酵素の反応機構解析2016

    • 著者名/発表者名
      木村哲就、武田英恵、石井頌子、當舎武彦、城宜嗣、久保稔
    • 学会等名
      第43回生体分子科学討論会
    • 発表場所
      名古屋大学(名古屋市)
    • 年月日
      2016-06-24 – 2016-06-25
  • [学会発表] NO reduction mechanism in the binuclear catalytic center of nitric oxide reductase revealed by novel micro-channel flow-flash spectrometers.2016

    • 著者名/発表者名
      T. Kimura, H. Takeda, S. Ishii, T. Tosha, Y. Shiro, M. Kubo
    • 学会等名
      Gordon Research Conference "Metallocofactors"
    • 発表場所
      Stonehill College (Easton, MA, USA)
    • 年月日
      2016-06-12 – 2016-06-17
    • 国際学会
  • [備考] タンパク質中の原子の動き、自由電子レーザーにより動画撮影に成功

    • URL

      http://www.kobe-u.ac.jp/NEWS/research/2016_12_26_01.html

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公開日: 2018-01-16   更新日: 2022-08-30  

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