新規時間分解計測法の開発とABCトランスポーターの分子機構解析への応用

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15H05476
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 木村 哲就 神戸大学, 理学研究科, 特命講師 (70506906)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 時間分解計測 / ABCトランスポーター / マイクロ流路デバイス / 顕微分光測定

研究実績の概要

生体分子あるいはその分子部分が『連動・協奏・相互作用』することによって実現される高次機能の分子機構解明を目的とし、それに係る新規時間分解測定装置の開発と応用を行なった。
研究対象として、ATPを利用して小分子を細胞膜の一方から他方へと輸送する膜タンパク質であるABCトランスポーターを選択し、その輸送・構造ダイナミクスを新規に開発する時間分解計測系によって観察し、①輸送を構成する化学反応の共役、②離合・集散を制御する分子間相互作用、③構造変化の連動性、を明らかにする。①②に関して以下の4種類の実験を行うことを目標とした。1) ヘム輸送ダイナミクスを可視吸収分光計測、2) ATP結合/加水分解反応を赤外吸収分光計測、3) ABCトランスポーターのコンフォメーション変化を分子内FRET蛍光寿命計測、4) ABCトランスポートシステムの離合・集散ダイナミクスを分子間FRET蛍光寿命計測によって明らかにする。また、③に関しては 5) 時間分解シリアルフェムト秒X線結晶構造解析を行う。
平成29年度には、前年度までに作製した分子拡散型マイクロ流路ミキサーを利用した顕微型可視吸収装置 [1)]、顕微赤外分光装置 [2)]、蛍光顕微鏡・蛍光寿命計測装置 [3), 4)] を用いて、ヘムのABCトランスポーターであるBhuUV-Tに対して時間分解測定を行った。その結果、BhuUVがヘムと結合したBhuTと特異的に結合すること、また加水分解に伴って結合型の形成が促進されることを見出した。5) に関しては光反応によって反応が誘起される膜タンパク質の時間分解X線結晶構造解析に成功し、複数の雑誌にその結果を報告した。また、溶液混合を用いた新規時間分解X線結晶構造解析法の構築を進めた。BhuUV-Tに関する結晶化を試み、ヌクレオチド結合型は解析には成功しなかったが、微結晶化条件の最適化を行なった。

現在までの達成度 (段落)

29年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

29年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [国際共同研究] California Institute of Technology(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: California Institute of Technology
• [雑誌論文] Ultraprecision cutting of single-crystal calcium fluoride for fabricating micro flow cells (2018)
  • 著者名/発表者名: Ryo KOMIYA, Tetsunari KIMURA, Takashi NOMURA, Minoru KUBO, Jiwang YAN
  • 雑誌名: J. Adv. Mech. Design, Sys., and Manuf. 巻: 12 ページ: JAMDSM0021
  • DOI: 10.1299/jamdsm.2018jamdsm0021
  • 査読あり
• [雑誌論文] A nanosecond time-resolved XFEL analysis of structural changes associated with CO release from Cytochrome c Oxidase (2017)
  • 著者名/発表者名: Atsuhiro SHIMADA†, Minoru KUBO†, Seiki BABA†, Keitaro YAMASHITA, Kunio HIRATA, Go UENO, Takashi NOMURA, Tetsunari KIMURA, (他18名), Hideo AGO*, Shinya YOSHIKAWA*, Tomitake TSUKIHARA* (†These authors contributed equally to this work.)
  • 雑誌名: Science Adv. 巻: 3 ページ: e1603042
  • DOI: 10.1126/sciadv.1603042
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Nanosecond pump-probe device for time-resolved serial femtosecond crystallography developed at SACLA. (2017)
  • 著者名/発表者名: Minoru KUBO, Eriko NANGO, Kensuke TONO, Tetsunari KIMURA, (他19名)
  • 雑誌名: J. Synchrotron Radiat. 巻: 24 ページ: 1086-1091
  • DOI: 10.1107/S160057751701030X
  • 査読あり
• [雑誌論文] Capturing an Initial Intermediate during the P450nor Enzymatic Reaction using Time-Resolved XFEL Crystallography and Caged-Substrate (2017)
  • 著者名/発表者名: Takehiko TOSHA†, Takashi NOMURA†, Takuma NISHIDA†, Naoya SAEKI, Kouta OKUBAYASHI, Raika YAMAGIWA, Michihiro SUGAHARA, Takanori NAKANE, Keitaro YAMASHITA, Kunio HIRATA, Go UENO, Tetsunari KIMURA, (他20名), Hiroshi SUGIMOTO*, Yoshitsugu SHIRO*, Minoru KUBO* (†These authors contributed equally to this work.)
  • 雑誌名: Nat. Commun. 巻: 8 ページ: 1585
  • DOI: 10.1038/s41467-017-01702-1
  • 査読あり
• [学会発表] 新規リアルタイム観察装置の開発によるタンパク質の分子機構解明への挑戦 (2018)
  • 著者名/発表者名: 木村哲就
  • 学会等名: 第6回K-CONNEX研究会
  • 招待講演
• [学会発表] 時間分解可視吸収分光測定によるヘム ABC トランスポーターの輸送メカニズム解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 林沙英, 城宜嗣, 杉本宏, 木村哲就
  • 学会等名: 第17回日本蛋白質科学会年会
• [学会発表] マイクロ流路ミキサーを用いた時間分解分光測定による ABC トランスポーターの分子機構解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 木村哲就, 林沙英, 大西萌, 城宜嗣, 杉本宏, 池本夕佳
  • 学会等名: 第17回日本蛋白質科学会年会
• [学会発表] ABCトランスポーターの分子機構解明を目指した時間分解測定法の開発 (2017)
  • 著者名/発表者名: 木村哲就, 林沙英, 大西萌, 城宜嗣, 杉本宏, 小堀康弘, 池本夕佳
  • 学会等名: 第44回生体分子科学討論会
• [学会発表] 可視吸収分光測定によるヘムABCトランスポーター; BhuUVの輸送メカニズム解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 林沙英, 城宜嗣, 杉本宏, 木村哲就
  • 学会等名: 第44回体分子科学討論会
• [学会発表] 時間分解分光法によるABCトランスポーターの輸送とATP加水分解過程の直接観察 (2017)
  • 著者名/発表者名: 木村哲就
  • 学会等名: 日本生物物理学会第54回年会
  • 招待講演
• [学会発表] 線虫cytochrome b561ホモログ・Cecytb-2の分子機能解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 藤村美香, 三浦雅央, 木村哲就, 鍔木基成
  • 学会等名: 日本生物物理学会第54回年会
• [学会発表] 時間分解可視・赤外吸収分光法を用いた一酸化窒素還元酵素のNO還元反応機構の解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 武田英恵, 木村哲就, 野村高志, 松林明子, 石井頌子, 當舎武彦, 城宜嗣, 久保稔
  • 学会等名: 日本生物物理学会第54回年会
• [学会発表] 可視吸収分光測定によるヘムABCトランスポーター; BhuUVの輸送メカニズム解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 林沙英, 城宜嗣, 杉本宏, 木村哲就
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会
• [学会発表] 線虫cytochrome b561ホモログ・Cecytb-2の分子機能解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 藤村美香, 三浦雅央, 木村哲就, 鍔木基成
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会