| 研究課題/領域番号 |
15H05490
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
佐藤 伸一 東京工業大学, 資源化学研究所, 助教 (20633134)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | タンパク質ラベリング / 反応空間制御 / 局所的反応 / 部位特異的修飾 / タンパク質複合体解析 |
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| 研究実績の概要 |
タンパク質1分子の大きさはおおよそ5～10 nmであり、タンパク質‐タンパク質相互作用におけるタンパク質間の距離を考慮すると、触媒から数nmの距離で完結する反応は“タンパク質の部位特異的ラベル化”に応用できる。また。触媒から数十nm以上の反応有効空間を達成することで、“タンパク質の会合状態を検出する方法”の開発に直結する。
H27年度の成果においては、ラジカル反応誘起触媒と反応点の位置を精密に制御する実験系と、細胞の任意のオルガネラに触媒を導入する実験系を構築した。
ラジカル反応誘起触媒－反応点距離の精密制御：申請者はこれまでに、Ru光触媒を用いたタンパク質チロシン残基の修飾法を開発してきた。この修飾反応においてチロシン残基からRu錯体へと一電子が移動する過程は生体環境下での一電子移動範囲を考慮するとRu錯体から数nmの範囲で完結すると考え,このRu錯体とチロシン残基の反応点間距離を解明することを目的とした。本年度、新たに作成したRu錯体－poly Pro linker－Tyr残基のペプチドでは、同一分子内に触媒部位と反応店部位を持ち、nmスケール以下での反応点間の距離調節が可能になった。本ペプチドを用いた実験によって、反応点間距離の重要性を明らかにするとともに、触媒からの特定の反応有効距離を持つ修飾剤をスクリーニング的に評価する実験系を構築することに成功した。
さらに、細胞内環境でタンパク質複合体解析を可能にする基盤技術開発に向けて、有用な実験系を確立することができた。すなわち、細胞内にラジカル有機触媒となる特定のperoxidaseを発現させ、それを用いたタンパク質修飾を評価する実験系を構築した。これにより、細胞内環境で機能するタンパク質修飾剤のスクリーニングが可能になった。これは、次年度以降の研究計画の足掛かりとなる重要な結果であると考える。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
H27年度の達成目標は、ラジカル誘起触媒と反応点となるチロシン残基間の距離を精密に制御できるペプチド基質の開発と、それを用いたnmスケールの反応有効距離を持つ修飾剤の創成であった。H27年度の結果においては反応点間の距離を制御したペプチドを合成し、それを用いた評価系によって反応点間距離の重要性を明らかにするとともに、触媒からの特定の反応有効距離を持つ修飾剤をスクリーニング的に評価する実験系を構築することに成功した。また、修飾剤、触媒の酸化還元電位測定により、ある程度系統的に、修飾剤の構造－機能性を予測することが可能になりつつある。現在は適切な、修飾剤の合成、選定に発展しており、異なるラジカル種寿命を持つ修飾剤を効率的に入手するための評価系構築に研究が進展している。
さらに、H28年度以降に計画していた、細胞内環境で機能するラジカル的タンパク質修飾剤についても着手した。具体的には細胞内の特定のオルガネラ局在タンパク質にperoxidaseをタグとして発現させ、それをラジカル誘起触媒として、細胞内のタンパク質ラベル化を行った。本実験系の構築により、細胞内環境でのタンパク質ラベル化、タンパク質複合体解析に適用できる修飾剤、ラベル化手法への発展に繋がると期待される。以上の結果より、研究開始当初の計画以上に順調に進行していると評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
H27年度の成果においては、ラジカル反応誘起触媒と反応点の位置を精密に制御する実験系と、細胞の任意のオルガネラに触媒を導入する実験系を構築した。H28年度からの研究においては、確立した実験系を用いて、以下の目的で研究を行う。
１．触媒からの距離nmオーダーの有効反応距離と修飾剤構造の構造－機能相関を明らかにする。：ペプチド性リンカーを用いて、Ru光触媒と反応点（チロシン残基）の距離を調節した反応基質の合成に成功しており、各修飾剤におけるラジカル的タンパク質修飾反応の有効距離・修飾効率を評価する実験系を構築している。そこで、新規修飾剤のデザインや構造展開、修飾剤ラジカルの特定を評価することで、触媒から数nmの距離で完結する修飾法と、数十nmの距離で有効な修飾法の2方面でそれぞれ最適な修飾剤を選定する。
2.ヘム結合タンパク質の3次元構造上での反応点解析：1．のRu光錯体に類似した一電子酸化能を持つ鉄‐ポルフィリン錯体を触媒として、チロシン残基をラベル化する手法を独自に見出している。また、ヘム結合タンパク質を基質として、反応点の位置のチロシン残基を同定することで、基質の3次元構造から、ラベリングの部位特異性を評価できる。本系により、タンパク質部位特異的修飾に適用できる修飾剤の創出を目指す。
3.細胞へのラジカル反応誘起触媒の導入：上記の方法とは別に生細胞内の任意のオルガネラに対してラジカル反応誘起触媒を導入する技術を習得している。そこで、触媒導入細胞内でのタンパク質ラベリングを1.,で選定する修飾剤を用いて、タンパク質会合状態を検出する方法への応用を目指す。
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