遺伝子組換え動物を用いた哺乳類生殖細胞特異的GPIアンカータンパク質の機能解析

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15H05573
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 藤原 祥高 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (70578848)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 哺乳類生殖細胞 / GPIアンカータンパク質 / 精子受精能 / 遺伝子組換えマウス / CRISPR/Cas9システム / ES細胞

研究実績の概要

今年度は、申請者が見つけた精子GPIアンカータンパク質Xと相互作用する精子膜タンパク質複合体2A/2BのKOマウスを作製し表現型解析（精巣重量、精巣切片、精子形態、精子運動性、体外受精など）を概ね遂行することができた。驚くべきことに、これら精子膜タンパク質のKOマウス精子も、精子受精能に必須の精子膜タンパク質ADAM3と関連することが明らかになった。また、以前報告した精子受精能に必須のGPIアンカータンパク質複合体TEX101/LY6KのKOマウスにおける2A/2Bタンパク質の動態を調べたところ、野生型との差は見られなかったことから、TEX101/LY6Kは精子形成過程に、2A/2Bは精子完成後において、ADAM3と共役して精子受精能を成立させていることが示唆された。今後は、その他のADAM3関連因子のKOマウスおよび2A/2BのKOマウスを用いて、これらの因子の存在や局在変化を調べたい。

また、従来のCRISPR/Cas9システムでは、点変異やノックイン導入効率が単純KOに比べて低かった。そこで、ES細胞を用いることで、これらの変異導入効率を飛躍的に向上させることに成功した（Sci Rep. 2016）。これにより、複雑な遺伝子改変にも対応できるようになり、今後の研究計画の進捗にも良い影響を与えるだろう。そして、これまではFLAGタグをノックインしたマウスを作製し解析に用いてきたが、複数因子の相互作用を調べるためにはFLAG以外のタグが必要になるため、新たなタグを持つノックインマウス作製が急務である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

今年度予定していた研究計画を概ね遂行し、本課題に関連する学術論文を発表することができたため。

今後の研究の推進方策

今年度、申請者が発見した精子GPIアンカータンパク質と相互作用する精子膜タンパク質複合体2A/2BのKOマウスを作製し、表現型解析を概ね遂行することができた。そして、ES細胞とCRISPR/Cas9システムを組み合わせた遺伝子改変法も確立したので、次年度はこれらタンパク質に対するタグノックインマウス作製して、相互作用する因子の同定を試みる。これと並行して、精子GPIアンカータンパク質の修飾機構の解明にも迫りたい。

研究成果

• [国際共同研究] Baylor College of Medicine(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Baylor College of Medicine
• [雑誌論文] A GPI processing phospholipase A2, PGAP6, modulates Nodal signaling in embryos by shedding CRIPTO. (2016)
  • 著者名/発表者名: Lee GH, Fujita M, Takaoka K, Murakami Y, Fujihara Y, Kanzawa N, Murakami KI, Kajikawa E, Takada Y, Saito K, Ikawa M, Hamada H, Maeda Y, Kinoshita T.
  • 雑誌名: The Journal of Cell Biology 巻: 215 ページ: 705-718
  • 査読あり
• [雑誌論文] CRISPR/Cas9 mediated genome editing in ES cells and its application for chimeric analysis in mice. (2016)
  • 著者名/発表者名: Oji A, Noda T, Fujihara Y, Miyata H, Kim YJ, Muto M, Nozawa K, Matsumura T, Isotani A, Ikawa M.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 6 ページ: 31666
  • DOI: 10.1038/srep31666
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Live imaging of X chromosome reactivation dynamics in early mouse development can discriminate naive from primed pluripotent stem cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi S, Hosoi Y, Shiura H, Yamagata K, Takahashi S, Fujihara Y, Kohda T, Okabe M, Ishino F.
  • 雑誌名: Development 巻: 143 ページ: 2958-2964
  • DOI: 10.1242/dev.136739
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structural and functional insights into IZUMO1 recognition by JUNO in mammalian fertilization. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kato K, Satouh Y, Nishimasu H, Kurabayashi A, Morita J, Fujihara Y, Oji A, Ishitani R, Ikawa M, Nureki O.
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 7 ページ: 12198
  • DOI: 10.1038/ncomms12198
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Genome engineering uncovers 54 evolutionarily conserved and testis-enriched genes that are not required for male fertility in mice. (2016)
  • 著者名/発表者名: Miyata H, Castaneda JM, Fujihara Y, Yu Z, Archambeault DR, Isotani A, Kiyozumi D, Kriseman ML, Mashiko D, Matsumura T, Matzuk RM, Mori M, Noda T, Oji A, Okabe M, Prunskaite-Hyyrylainen R, Ramirez-Solis R, Satouh Y, Zhang Q, Ikawa M, Matzuk MM.
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 巻: 113 ページ: 7704-7710
  • DOI: 10.1073/pnas.1608458113
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] The Mg2+ transporter CNNM4 regulates sperm Ca2+ homeostasis and is essential for reproduction. (2016)
  • 著者名/発表者名: Yamazaki D, Miyata H, Funato Y, Fujihara Y, Ikawa M, Miki H.
  • 雑誌名: Journal of Cell Science 巻: 129 ページ: 1940-1949
  • DOI: 10.1242/jcs.182220
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] GPI-AP release in cellular, developmental, and reproductive biology. (2016)
  • 著者名/発表者名: Fujihara Y, Ikawa M.
  • 雑誌名: Journal of Lipid Research 巻: 57 ページ: 538-545
  • DOI: 10.1194/jlr.R063032
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] 生殖不全の表現型解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 藤原祥高，佐藤裕公，伊川正人
  • 雑誌名: 実験医学別冊マウス表現型解析スタンダード 巻: 1 ページ: 216-227
• [備考] 大阪大学 研究者総覧
  • URL: http://www.dma.jim.osaka-u.ac.jp/view?l=ja&u=6639
• [備考] 大阪大学微生物病研究所 遺伝子機能解析分野 メンバー紹介ページ
  • URL: http://www.egr.biken.osaka-u.ac.jp/information/yoshitaka_fujihara.html