光化学系II膜蛋白質のpHトラップによるS2反応中間体の結晶構造解析

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15H05588
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 梅名 泰史 岡山大学, 異分野基礎科学研究所, 特別契約職員(准教授) (10468267)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: X線結晶構造解析 / 光化学系II蛋白質 / 光合成 / 膜蛋白質結晶化 / 混合緩衝液

研究実績の概要

植物や藻類で行われる酸素発生型光合成反応で働く光化学系II蛋白質(PSII)は光エネルギーを使って水を酸化分解して化学エネルギーの生産に必要な電子源を作り出している。本研究では好熱性シアノバクテリアThermosynechoccous vulcanus（TV細胞) 由来のPSIIを精製・結晶化し、結晶母液のpHを変えることで起こるアミノ酸残基の構造変化や水分子の位置の違いからPSIIの機能部位における最適な構造について検証し、PSIIの水素イオン濃度（pH）に依存した機構の解明を研究の目的としている。
初年度の研究で、PSIIの結晶化試料の調製法を確立する事ができたため、PSII結晶を様々な市販の結晶化溶液で結晶化を試みたところ、pH4からpH9の範囲で単結晶を得ることが分かった。本年度ではさらに条件を突き詰めるため、PSII結晶を大量に調製し、結晶母液の緩衝液を変えてPSIIのpH可変による結晶構造解析を試みた。しかし、酸性側の溶液としてクエン酸緩衝液および酢酸緩衝液を試みたが、十分な分解能の回折データを得ることができなかった。pHおよび緩衝液の種類の変化による結晶性の低下を止めることができなかったと思われる。一方グルタミン酸緩衝液を用いた場合、pH5では水分子の位置やアミノ酸側鎖の構造を捉えることができる2.2Å分解能の回折データが得られた。
上記の問題から、緩衝液を変えることなくpHを変化させるため、マロン酸、イミダゾール、ホウ酸の混合緩衝液を実験に用いたところ、中性付近で1.9Å分解能の回折強度データを得ることができた。この結果から結晶性を落とすこと無く、穏やかに溶液のpHを可変することができるものと期待される。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究ではpH可変による蛋白質構造の変化を見出すことを目指している。結晶化条件のスクリーニングからpH4からpH9の範囲で単結晶が得られる事が確認できたことから、本研究を推進できるものと思われる。また、pH5の条件でアミノ酸側鎖や水分子を確認できる十分な分解能の回折強度データを得ることできた。また、緩衝領域の異なる３種類の緩衝液を混合して用いたところ結晶に影響の少ない混合緩衝液を特定する事ができた。これらの事から結晶性を損なうことなく穏やかに結晶のpHを変化できるものと期待される。

今後の研究の推進方策

本研究ではPSII結晶のpHを可変させた結晶構造解析を目的としている。今回、緩衝液を変えることなくpHを変化させるためマロン酸、イミダゾール、ホウ酸の混合緩衝液を実験に用いたところ、中性付近で1.9Å分解能の回折強度データが得られたことから、この混合緩衝液を用いて様々なpH状態について検討を進める予定である。
pH可変によるS2反応中間状態をトラップする手法については励起光が十分に透過する微小結晶での実験を行う予定である。微小結晶にQスイッチのNd:YAGパルスレーザーを照射し、直後に瞬間的に凍結する手法を検討する。凍結した結晶の蛍光X線吸収スペクトル分析から、活性中心のMnクラスターの価数変化が確認されたことから、結晶を十分に励起できるものと期待される。

研究成果

• [雑誌論文] Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. (2017)
  • 著者名/発表者名: Suga M, et al (著者38人中8番目）
  • 雑誌名: Nature 巻: 543 ページ: 131-135
  • DOI: 10.1038/nature21400
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dynamics of Excitation Energy Transfer Between the Subunits of Photosystem II Dimer. (2016)
  • 著者名/発表者名: Yoneda Y, Katayama T, Nagasawa Y, Miyasaka H, Umena Y.
  • 雑誌名: J Am Chem Soc. 巻: 138 ページ: 11599-11605
  • DOI: 10.1021/jacs.6b04316
  • 査読あり
• [学会発表] 光化学系IIと阻害剤アジ化物イオンとの共結晶化とX線結晶構造解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 田丸 翔也, 梅名 泰史, 沈 建仁
  • 学会等名: 第54回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば、茨城（ポスター）
  • 年月日: 2016-11-25 – 2016-11-27
• [学会発表] 活性阻害剤アジ化物イオンが結合した光化学系 II 蛋白質の X 線結晶構造解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 梅名泰史・田丸翔也・沈建仁
  • 学会等名: 日本結晶学会平成28年度年会
  • 発表場所: 水戸、茨城（ポスター）
  • 年月日: 2016-11-17 – 2016-11-18
• [学会発表] 光化学系IIタンパク質における混合原子価Mn4CaO5クラスターの結晶構造解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 梅名泰史, 川上恵典, 神谷信夫, 沈建仁
  • 学会等名: 第55回電子スピンサイエンス学会年会
  • 発表場所: 大阪市立大学、大阪
  • 年月日: 2016-11-10 – 2016-11-12
  • 招待講演
• [学会発表] Crystallographic studies of the valence of four Mn atoms in photosystem II using anomalous diffraction technique (2016)
  • 著者名/発表者名: Y. Umena, K. Kawakami, N. Kamiya, J.-R. Shen
  • 学会等名: The 42nd Naito Conference
  • 発表場所: 札幌、北海道（ポスター）
  • 年月日: 2016-10-04 – 2016-10-07
• [学会発表] Estimation of valences and radiation damage of four Mn atoms in photosystem II crystals using anomalous diffraction analysis (2016)
  • 著者名/発表者名: Y. Umena, K. Kawakami, N. Kamiya, J.-R. Shen
  • 学会等名: The 12th International Conference on Biology and Synchrotron Radiation (BSR 2016)
  • 発表場所: Menlo Park, CA, USA
  • 年月日: 2016-08-21 – 2016-08-24
  • 国際学会
• [学会発表] Crystal structure of the oxygen evolving photosystem II in the intermediate state revealed by femtosecond X-ray free electron lasers (2016)
  • 著者名/発表者名: M. Suga, F. Akita, M. Kubo, Y. Nakajima, K. Yamashita, T. Nakane, M. Nakabayashi, Y. Umena, M. Suzuki, E. Nango, R. Tanaka, S. Inoue, T. Masuda, K. Tono, T. Kimura, Y. Joti, M. Yamamoto, O. Nureki, M. Yabashi, T. Ishikawa, S.o Iwata, M. Sugawara, J.-R Shen
  • 学会等名: The 17th International Congress on Photosynthesis Research
  • 発表場所: Maastricht, Netherland
  • 年月日: 2016-08-07 – 2016-08-12
  • 国際学会
• [学会発表] Valences and radiation damage of four Mn atoms in photosystem II crystals revealed by anomalous diffraction analysis (2016)
  • 著者名/発表者名: Y. Umena, K. Kawakami, N. Kamiya, J.-R. Shen,
  • 学会等名: The 17th International Congress on Photosynthesis Research
  • 発表場所: Maastricht, Netherland（ポスター）
  • 年月日: 2016-08-07 – 2016-08-12
  • 国際学会
• [学会発表] Crystal structure analysis of photosystem II complex from an SQDG-deficient mutant of Thermosynechococcus elongatu (2016)
  • 著者名/発表者名: Y. Nakajma, Y. Umena, K. Endo, H. Wada, J.-R. Shen
  • 学会等名: The 17th International Congress on Photosynthesis Research
  • 発表場所: Maastricht, Netherland（ポスター）
  • 年月日: 2016-08-07 – 2016-08-12
  • 国際学会
• [学会発表] X-ray crystallographic studies of active sites in oxygen-evolving photosystem II (2016)
  • 著者名/発表者名: Y. Umena
  • 学会等名: 13th International Workshop on Supermolecular Nanoscience of Chemically Programmed Pigment (SNCPP13)
  • 発表場所: Ritsumeikan University, Shiga, Japan
  • 年月日: 2016-06-17 – 2016-06-19
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] スルフォキノボシルジアシルグリセロール欠損T.elongatus変異体由来PSⅡ複合体ダイマーの結晶構造 (2016)
  • 著者名/発表者名: 中島芳樹、梅名泰史、遠藤嘉一郎、和田元、沈建仁
  • 学会等名: 第７回日本光合成学会年会
  • 発表場所: 東京理科大学、日本（ポスター）
  • 年月日: 2016-05-27 – 2016-05-28
• [学会発表] 光化学系IIの４つのMnの価数とＸ線による還元作用の検証 (2016)
  • 著者名/発表者名: 梅名泰史、川上恵典、神谷信夫、沈建仁
  • 学会等名: 第７回日本光合成学会年会
  • 発表場所: 東京理科大学、日本（ポスター）
  • 年月日: 2016-05-27 – 2016-05-28