| 研究課題/領域番号 |
15H05596
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
千葉 秀平 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (60572493)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 一次繊毛 / 基底小体 / 中心体構造変換 / 細胞周期 / チェックポイント / 多繊毛細胞 / 超解像度顕微鏡 / Appendage |
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| 研究実績の概要 |
中心体は増殖相分裂期では紡錘体の極として均一な遺伝情報の分配に関わる一方で、休止相では繊毛の基部で基底小体として細胞外環境の受容を担っており、細胞周期の各段階でその機能ならびに構造を柔軟に変化させる。細胞周期と同調した中心体の機能・構造変化に関わる分子システムの詳細は依然として不明のままである。申請者は一次繊毛形成時に、中心体から基底小体への変換 (中心体-基底小体変換)に関わる因子が、増殖相進行中には意外なことに中心体外で細胞周期の進行を監視する機能を保持している可能性を見出した。本研究は、この”非繊毛機能”と”中心体構造変換”の 二役を一手に担う蛋白質群の発見をもとに、細胞周期と密接な同調性をもつ中心体の機能変換の分子基盤を世界に先駆けて明示することが目的である。
本年度は当初の研究計画通り、Appendageキナーゼの活性を制御する上流機構の解析ならびにAppendageキナーゼの生理基質の探索実験に着手した。また、一部のAppendage関連因子がLys63結合型ポリユビキチン化修飾を受けることを新規に見出した。現時点ではユビキチン化修飾とこれら因子の核内集積の関連は不明であるが、本研究の主旨であるAppendageタンパク質の”非中心体機能”と”中心体構造変換機能”を調節する機構の実態解明へと繋がることも期待される。さらに、Air-liquid interface(ALI)によるマウス気管上皮の初代培養細胞システム (mTEC)を構築し、一般的な培養細胞を用いた実験系では解析困難な細胞周期チェックポイント関連因子の中心体-基底小体変換機能の特定のための実験系を整備した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1) Appendageキナーゼの基質探索実験
ATP結合部位への変異導入から、ATPに対する結合活性をほぼもたない一方で、N6-Benzyl-ATPgammaSへの結合能をもつAS-Appendageキナーゼを創出した。AS-キナーゼはN6-Benzyl-ATPATPgammaS存在下では、基質蛋白質に対してチオリン酸を付加するという特性を持つ。今後はチオール反応性レジンによる基質蛋白質のアフィニティー精製、LC-MS/MSによる質量分析を行うことで生理基質の同定を目指す。
2) Appendageキナーゼの上流機構解析
既存のリン酸化プロテオミクス解析と蛋白質一次配列解析に基づくin silico解析の統合的理解により、Appendageキナーゼの上流因子の推定を行った。この候補因子はすでにチェックポイント機能を有していることが実験的にも示されている因子であるが、現時点でこの因子の阻害剤の投与がAppendageキナーゼが関与する一次繊毛形成を阻害することを見出した。さらにmTecへの阻害剤の投与でも多繊毛構築が阻害された。
3) Appendage複合体の核内集積調節機構の解析
Appendageタンパク質の核内集積を調節する機構を解明するため、既知のDNAダメージ修復関連タンパク質によるAppendageタンパク質のリン酸化制御に加え、ユビキチン化、SUMO化、アセチル化といった各種翻訳後修飾による制御も想定し、解析を行った。この結果、Appendageタンパク質のひとつがLys63結合型ポリユビキチン化修飾を受けることを見出した。現時点では核内集積との関連は不明であるが、Appendageタンパク質の”非中心体機能”と”中心体構造変換機能”を調節する機構の実態解明へと繋がることが期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
アナログ感受性(AS)キナーゼを利用したリン酸化特異的covalent capture法により明らかになると期待される基質因子の同定により、Appendageタンパク質の”非中心体機能”と”中心体構造変換機能”を調節する一連のシグナル伝達経路の解明を目指す。また、上流因子によるAppendageキナーゼの制御機構の解析についても引き続き解析を続ける。特に上流因子ならびにAppendageキナーゼの発現抑制が多繊毛構築において起こる中心体-基底小体変換のどのプロセスを阻害しているのかを超解像度顕微鏡を用いて光学的に解析する。加えて、Appendageタンパク質のLys63結合型ポリユビキチン化修飾の核内集積への関連を解析する。
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