| 研究課題/領域番号 |
15H05619
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
杉本 真也 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (60464393)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | バイオフィルム / 細胞外マトリクス / RNA / DNA / 分子シャペロン / 多糖 / 共焦点レーザー顕微鏡 / 分子間相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
①菌体外核酸の塩基配列の決定： 黄色ブドウ球菌のバイオフィルムマトリクスに含まれる低分子RNAがバイオフィルムの構造維持に重要であることを発見した。本研究では、それら低分子RNAのうち塩基数が約100までのものについてRNA-seqで解析した。その結果、黄色ブドウ球菌に由来する特定のRNAがバイオフィルムマトリクスに含まれることを確認することができた。また昨年度のドラフトゲノム解析とは異なる手法を用いた全ゲノムおよび菌体外DNAの塩基配列を取得するため、高純度かつ高濃度のサンプルを精製した。現在、PacBioを用いた塩基配列の取得およびデータ解析を進めている。
②菌体外における低分子RNAの局在観察： 超解像顕微鏡を用いた低分子RNAの局在を高分解能で観察する手法を開発した。その結果、RNAが菌体外多糖と共局在することを見出した。また、ビアコアをもちいた多糖とRNAの分子間相互作用解析の結果、多糖とRNAが直接結合することを確認した。
③DnaKが認識する菌表層分子の探索：これまでに我々は細胞質分子シャペロンであるDnaKがブドウ球菌の菌体表層に結合することで、バイオフィルム形成を促進することを見出している。本研究では、DnaKが認識する菌表層分子の探索を行うため、バイオイフィルムマトリクスタンパク質・細胞壁アンカータンパク質・壁タイコ酸合成酵素・菌体外多糖合成酵素などコードする遺伝子の欠損株を作製した。これらの遺伝子欠損株のうち一部についてはDnaKの結合能が低下することがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の目標の一つであった菌体外RNAの局在を明確に可視化することができたため、おおむね順調に進展していると判断する。しかし、その他にも計画していた、DnaKが認識する菌表層分子の探索については、実験はしているものの際立った結果が得られるに至っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
２９年度は、当初の目標であった黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成における菌体外核酸の全体像と菌体外分子シャペロンの作用機構を把握することに注力する。具体的には、①黄色ブドウ球菌バイオフィルム高形成株の全ゲノム配列および菌体外DNAの全塩基配列の決定し、バイオフィルムマトリクスに含まれる菌体外DNAの実体を明らかにする、②RNA-多糖間相互作用の速度論的な解析を進め、親和定数・結合速度定数・解離速度定数を決定し、その生理的な意義の理解につなげる、③細胞壁アンカータンパク質・菌体外多糖・壁タイコ酸・ペプチドグリカンと分子シャペロンDnaKの相互作用を解析し、DnaKの菌体表層に結合する分子機構を明らかにする。
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