| 研究課題/領域番号 |
15H05621
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
宮川 拓也 東京大学, 農学生命科学研究科, 助教 (50596559)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 植物ホルモン / サリチル酸 / 抵抗性誘導剤 / X線結晶構造解析 |
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| 研究実績の概要 |
全身獲得抵抗性（SAR）はサリチル酸（SA）により誘導される植物の免疫応答であり、広範な作物品種とその病害に対して、SARを誘導する薬剤「抵抗性誘導剤」の利用拡大が望まれている。本研究では、植物が普遍に備えていると考えられるSAR誘導機構を標的として新規抵抗性誘導剤の開発を目指し、SAがその受容体であるNPRタンパク質を選択的に制御するために必要な構造基盤を解明するため、X線結晶構造解析に適用可能な純度のタンパク質試料の取得と生化学的解析を実施した。
本研究の解析対象であるArabidopsis thaliana由来NPRタンパク質NPR1, NPR3, NPR4の大腸菌発現系を構築し、各種クロマトグラフィーによる精製条件を確立した。これにより、生化学的解析・結晶化スクリーニングに供するためのタンパク質試料を取得した。この試料を用いて、NPR3及びNPR4がNPR1と複合体を形成することがGSTプルダウンアッセイにより確認された。また、各NPRタンパク質に対するSAの直接的な結合は等温滴定カロリメトリー（ITC）により評価した。SAの結合に伴う熱変化量が小さいため結合定数の評価に関しては、今後、他の手法を用いた検証が必要である。一方、NPR3, NPR4及びNPR1との複合体の結晶化スクリーニングを順次実施した結果、本年度はNPR4の結晶を取得することができた。結晶化条件の最適化を経て、結晶構造の決定につなげる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初予定していたNPRタンパク質NPR1, NPR3, NPR4の発現・精製条件を確立し、本研究を遂行するためのタンパク質試料を供給する体制が整った。また、生化学的な解析を実施し、NPRタンパク質の複合体形成が確認された。SA結合の定量評価に関しては他の手法を用いた検証が必要と考えているが、結晶化スクリーニングまでおおむね順調に進み、NPR4の結晶を取得するに至っている。このため、今後引き続き研究を実施することにより、本研究の目的であるNPRタンパク質の構造決定が期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
NPRタンパク質の精製条件の検討過程で、NPR1, NPR3, NPR4のいずれも凝集し易いことがわかり、アミノ酸残基の置換、N末端及びC末端のアミノ酸残基の除去または可溶性タグの付加など、性状が改善した複数のコンストラクトを取得している。現時点で当初予定よりも多数のコンストラクトの検討が必要であるが、これらの結晶化スクリーニングを網羅的に行い、結果のフィードバックと改善を図りながらX線結晶構造解析を推進する。
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