研究課題
我々に内在する概日時計システムは、進化上高度に保存された形質である。組織破壊や移植実験から、時計の中枢は脳の視交叉上核（SCN）であることがわかった。しかしながら、個々のSCN神経細胞やSCN切片では、個体で観察されるような安定した固有周期を示さないことから、個体全身に張り巡らされた時刻制御ネットワークにより、概日時計の恒常性が形成されると考えられている。しかしながら、この分子・神経回路の実態はほとんど不明である。そこで、私は時差実験を利用して、このシグナル伝達網の解明を試みている。時差により明暗位相を急激に変動させると、SCNはそれまでの安定振動を一旦破棄し、その後に新明暗位相に応じた概日振動を再構築する。この再構築に関与する分子神経機構を解明することで、恒常性を担う時刻制御網を同定する。私はSCNをターゲットとした時差責任分子のスクリーニングを行い、時差後の新しい明暗環境に再同調するのに野生型マウスでは10日程度を要するところ、バソプレッシン（AVP）の受容体であるV1aとV1bを共に欠損したダブルノックアウトマウス（V1aV1bDKOマウス）では瞬時に再同調することを見出した。また、野生型マウスのSCNにV1aとV1bのアンタゴニストを投与することで、時差期間を半減させることに成功した。このことより、概日時計の恒常性はSCNのみならず、他の器官・組織によっても制御されると示唆される。そこで、V1aおよびV1b受容体のそれぞれが、体のどの部位で、どのようなシグナル伝達を介して時差を制御するのかの解明を試みている。また、実際の時差環境下での動物のSCNにおける時計遺伝子を測定するには、自由行動下の動物のSCNにおける時計遺伝子のリアルタイムモニタリングが必要であるが、私は今回、自由行動下のラットSCNからの時計遺伝子Per1とPer2のモニタリングに成功した。
2: おおむね順調に進展している
本年度の計画の一つとして、自由行動下動物のSCNにおける時計遺伝子のin vivoリアルタイムモニタリング概日振動解析をあげていたが、私は、Per1あるいはPer2のプロモーターでルシフェラーゼ（luc）を発現する2種類のトランスジェニックラット（Per1-lucラットおよびPer2-lucラット）を用いて、この課題に取り組んだ。自由行動下のこれらのラットSCNに光ファイバーを挿入し、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを浸透圧ポンプによりSCNに持続投与した。また、ラットが自由に行動できるように、光ファイバーをシーベルで連結し、生体発光の計測は、恒暗条件下で行った。すると、Per1-lucラットおよびPer2-lucラットのどちらを用いた場合でも、長期間にわたって明瞭な概日リズムを示す生体発光を計測することに成功した。これらの発光リズムを解析したところ、振動の大きさは共におよそ2倍であり、周期長はどちらも24時間であった。しかし、振動のピーク時刻は異なっており、Per1-lucの発光ピークは主観的明期の中頃に、Per2-lucの発光ピークはそれより3時間程度遅れていた。これらのピーク時間の違いは、レーザーマイクロダイセクション法を用いて、SCNのみを単離したサンプルを用いたリアルタイムPCR法による定量によっても示された。したがって、今後は、時差のようなSCNへの外乱環境下で、Per1やPer2がどのように変動するかをモニターし、これらの再同調過程や行動リズムとの関連の解明へと研究を展開することができることとなった。
上記の時計遺伝子リアルタイム変動計測は、自由行動下のラットを用いたものである。そこで、この手技をマウスに応用することを試みる。これが成功すれば、種々の遺伝子改変マウスを用いて、概日行動リズムと時計遺伝子の発現変動の解析が可能となる。特に、時差のないV1aV1bダブルノックアウトマウスと野生型マウスとの比較に注目している。レポーターとして、私たちは、Per1-lucトランスジェニックマウスを使用している。また、私は、SCNのAVP細胞間の結合が時差の原因であることを報告したが、この結合に基づいた数理モデルを作製し、時差時のシミュレーションを行ったところ、外界の明暗情報が入力するVIP細胞は再同調を促進し、AVP細胞は抑制すると予想された。そこで、これらの細胞群の活動を特異的に操作することで、再同調の速度が変化するかを測定していく。また、時差異常マウスのスクリーニングを継続して行っており、V1aとV1bに関与するシグナル伝達が阻害されたマウスにおいて、時差に有意に早く再同調するものや、逆に再同調に長期間を要するものを新たに見出している。そこで、これらの新規時差異常マウスの解析やV1aV1bDKOマウスにおけるこれらのシグナル伝達の測定により、V1aとV1bの時差シグナル伝達機構を分子・神経レベルで解明する。
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Journal of Biological Rhythms
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Yakugaku Zasshi
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