研究課題
水に不溶性の蛍光物質であるベンゾチアゾリルフェノール誘導体（BTP3）にシアル酸（Neu5Ac）を付加したシアリダーゼ蛍光イメージング剤「BTP3-Neu5Ac」を開発した。シアリダーゼを発現するインフルエンザA型及びB型ウイルス感染細胞を蛍光イメージングすることができ、蛍光化された細胞からはウイルス株の単離もできる。本研究はシアリダーゼ蛍光イメージング剤を利用して、ウイルスシアリダーゼの機能解析と抗インフルエンザ薬（シアリダーゼ阻害剤）の耐性化検出法の開発を行う。BTP3-Neu5Acがシアリダーゼを持つパラインフルエンザウイルスである、ヒトパラインフルエンザウイルスやおたふく風邪ウイルス、さらにこれらの感染細胞に発現するシアリダーゼ活性を蛍光イメージングすることに成功した。バキュロウイルス-タンパク質発現システムによりインフルエンザA型ウイルスの膜糖タンパク質であるノイラミニダーゼ（NA、シアリダーゼ）を分泌型タンパク質に改変し、精製した。細胞内への取り込まれる様子をBTP3-Neu5Acによりイメージングすることを試みるため、このシアリダーゼにエンドサイトーシスシグナルを挿入した分泌型NAを作製した。また、抗インフルエンザ薬（シアリダーゼ阻害剤）に耐性化したインフルエンザA型ウイルスやその感染細胞あるいは薬剤耐性化変異を導入したシアリダーゼ発現細胞を選択的に蛍光イメージングする方法を確立した。薬剤耐性ウイルスの感染細胞集団を選択的に蛍光イメージングし、薬剤耐性株を高効率に単離することにも成功した。
1: 当初の計画以上に進展している
シアリダーゼ蛍光イメージング剤「BTP3-Neu5Ac」が、シアリダーゼを持つヒト病原ウイルスであるヒトパラインフルエンザウイルスやおたふく風邪ウイルスとそれらの感染細胞の蛍光イメージングに利用できることを報告した。これらのウイルスの蛍光化された感染細胞集団から、ウイルス株の単離も可能である。バキュロウイルス-タンパク質発現システムにより酵素活性を有するNAを生産することに成功した。また、インフルエンザA型ウイルスのNAは膜糖タンパク質であるため、溶液中では可溶化せずに凝集する。タンパク質を回収するとき細胞を破砕する必要があるため、細胞内在性のタンパク質の混在や精製操作の煩雑さなどの問題がある。そこで、シアリダーゼの膜貫通領域を除去し、分泌型タンパク質に改変した分泌型NAの生産及び精製に成功した。また、エンドサイトーシスシグナルを挿入した分泌型NAも作製した。これらのNAのシアリダーゼ活性を確認した。BTP3-Neu5Acと抗インフルエンザ薬（NA阻害剤）を併用することで、簡便、迅速に薬剤耐性インフルエンザウイルスやその感染細胞を選択的に蛍光イメージングすることに成功した。薬剤耐性ウイルスと感受性ウイルスの混合液の感染細胞から、薬剤耐性ウイルス感染細胞を蛍光イメージングすることで、薬剤耐性ウイルス株の極めて高効率な単離に成功したことは予想以上の結果であった。
シアリダーゼ蛍光イメージング剤「BTP3-Neu5Ac」の応用法を確立していく。特に本研究では、インフルンザウイルス感染におけるシアリダーゼ活性の意義解明とインフルンザウイルスのNA阻害剤に対する薬剤耐性化機構の解析を、シアリダーゼ蛍光イメージング剤を活用して進める。バキュロウイルス-タンパク質発現システムにより分泌型NAを生産できたことから、エンドサイトーシスシグナル挿入シアリダーゼによりウイルスの細胞侵入過程（エンドサイトーシス過程）を疑似的に再現させ、エンドサイトーシス過程におけるシアリダーゼ活性の機能について解析する。エンドサイトーシス下のNAのシアリダーゼ活性を継時的に蛍光イメージングし、pHの低下に依存してどこまで活性が維持されるのかを検討する。また、ネイティブのNAがホモ四量体であることから、四量体化シグナルを挿入した分泌型NAタンパク質四量体の作製を試みる。ウイルス表面上のネイティブに近いNAの機能解析が実施できるものと予想される。薬剤耐性インフルエンザウイルスの高効率単離法を確立したので、シアリダーゼ阻害剤存在下で増殖性を獲得したウイルスを本法により選択的に単離していき、そのシアリダーゼ遺伝子配列を解析する。薬剤耐性化変異を効率的に解析することができる。未報告の変異についてはシアリダーゼ遺伝子に導入して哺乳動物細胞へ発現させる。各抗インフルエンザ薬に対する感受性を比較する。
研究代表者の受賞 2件：日本ウイルス学会 平成27年度 杉浦奨励賞、静岡県立大学（第二回）学長表彰研究協力者の受賞 8件
すべて 2016 2015 その他
すべて 雑誌論文 (17件) (うち国際共著 1件、 オープンアクセス 9件、 査読あり 14件、 謝辞記載あり 6件) 学会発表 (37件) (うち国際学会 2件、 招待講演 5件) 備考 (5件)
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