| 研究課題/領域番号 |
15H05682
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
根来 宏光 京都大学, 医学研究科, 助教 (80708595)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 排尿障害 / 時間生物学 / 尿路上皮 / コネキシン43 / Bmal1 |
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| 研究実績の概要 |
時計遺伝子Per2::Lucマウスの膀胱尿路上皮の発光リズムをex vivoにて測定し、マウス膀胱尿路上皮には概日リズムが存在することを明らかにした。また、マウスの尿路上皮を、4時間毎に連続7ポイントで採取し、RT-PCR法、immunoblotにて、時計遺伝子、Cx43の発現量を評価したたところ、主要時計遺伝子だけでなくCx43にも概日リズムが存在していることが明らかになった。また、マウス膀胱内に一定水圧を加えた後の膀胱内ATP濃度にも日内差が存在しており、これは膀胱尿路上皮におけるCx43の日内差に正相関していた。さらにATP放出量はCx43強制発現株で有意に上昇、抑制株で低下し、GAP19（Cx43ヘミチャネル特異的阻害薬）存在下では培養細胞だけでなくマウス膀胱内においてもATP濃度は低下し、尿路上皮におけるCx43ヘミチャネルの機能を明らかにした。
また、2光子励起顕微鏡を用いたin vivo imagingの手法で、マウスの生体内での尿路上皮の観察を行った。その結果、マウスの尿路上皮に伸展刺激が加わることで尿路上皮から放出されたATPは、尿路上皮細胞で細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）活性を上昇させることをin vivo imagingで確認することに初めて成功し、論文発表した。
一方、尿路上皮特異的に主要時計遺伝子Bmal1およびギャップ結合構成蛋白コネキシン43をノックダウンしたマウスの作製を行い、それぞれ目的の遺伝子型を持つマウスを作製した。尿路上皮での目的遺伝子の組み換えを、DNAレベルでは確認されたが、mRNA、蛋白レベルでのノックダウン効率が不十分な結果であり、現在他の方法での作製を検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
尿路上皮に概日時計が存在する事、Cx43が概日リズムを呈し、ATP放出経路となりうるヘミチャネル機能も有しているこを明らかにし、学会発表した。またIn vivo imagingの手法で、尿路上皮に対する進展刺激が加わった際にATPが放出され、ERK活性につながることをimaging技術でとらえることに初めて成功し、これを論文発表した。
一方、目的の遺伝子配列を持つマウスの作製には成功したが、理論通りのノックダウン効率が得られておらず他の方法での作製を試みている。
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| 今後の研究の推進方策 |
遺伝子組み換え酵素Creの活性化に、タモキシフェンの存在を必要としないCreマウスを譲渡頂く予定で海外施設からの搬入待ちの状態である。一方、尿路上皮特異的では無い、全身での遺伝子改変マウスを用いた排尿行動解析、膀胱内圧測定は継続して進めていく予定である。
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