| 研究課題/領域番号 |
15H05713
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
藤堂 剛 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (90163948)
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| 研究分担者 |
辻村 亨 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (20227408)
弓場 俊輔 国立研究開発法人産業技術総合研究所, その他部局等, 研究員 (40263248)
瀬々 潤 国立研究開発法人産業技術総合研究所, その他部局等, 研究員 (40361539)
川崎 隆史 国立研究開発法人産業技術総合研究所, その他部局等, 研究員 (60356839)
藤原 智子 (石川智子) 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (70402922)
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| 研究期間 (年度) |
2015-05-29 – 2020-03-31
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| キーワード | 損傷応答 / ゲノム編集 / 突然変異 / 体組織幹細胞 / メダカ |
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| 研究実績の概要 |
我々のゲノムDNAは, 常に、外的・内的要因によるDNA損傷の脅威にさらされている。DNA損傷は「ゲノム不安定性」を誘発し、やがて長期潜伏期の後、発がん等の重篤な疾患をひきおこす。この様な晩発影響の標的細胞として「組織幹細胞」が重要な役割を果たしている。本研究では、「組織幹細胞」に誘発される「ゲノム不安定性」を直接検出するin vitro, in vivo解析系を構築し、環境変異源に対する「組織幹細胞」の損傷応答機構を明らかにする研究を提案している。本年度は以下の成果を得た。
１）体組織レベルでの損傷応答解析には関与する遺伝子の変異体が必須である。これまで化学変異原ランダムmutagenesis (TILLING法)により変異体作製を行ってきたが、更にゲノム編集技術を導入し網羅的損傷応答関連遺伝子変異体作製を行った。損傷乗越えDNA複製酵素(TLS polymerase)は損傷応答によるゲノム変異誘発の最大因子であるが、メダカにおいてこれ等TLS pol 遺伝子群（Rev3, Rev7, PolH,P oiI, PolK, PolN, PolQ）変異体を網羅的に作成した。
２）損傷応答を，その最終産物である突然変異誘発としてゲノムレベルで検出する事を目指している。エキソーム解析で得られる情報には限りが有り、全ゲノム解析を行う為のアルゴリズム樹立を行い、培養細胞でのゲノム解析が可能である事を明らかにした。
３）個体レベルでの組織幹細胞解析系には、高効率でしかもゲノムレベルでの遺伝子導入法の樹立が必須である。これまでに開発した遺伝子導入法を改変し, 高効率遺伝子導入を可能にした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の格子は、１）体組織損傷応答解析系の確立、２）損傷応答をゲノム変異として検出する系の確立、３）新たな組織幹細胞解析系の確立、の３点からなる。
１）に関しては、損傷応答に関わる遺伝子変異体の作成がまず必要となる。我々は既にTILLING法により多くの損傷応答変異体を樹立しているが、平成２７年度においては、これに加えゲノム編集技術を用い網羅的変異体作成を行った。目標は充分達成できたと判断している。
２）に間しては、次世代シークエンサー(NGS)による誘発突然変異解析の方法論確立となる。本申請では、メダカあるいはラット（あるいはヒト）のゲノムが対象となる。特にメダカゲノムはヒトに比べ解析データ数が少ないため、より正確な変異同定が必要となる。細胞レベルでの解析が可能になり、目標は充分達成できたと判断している。
３）に関しては、トランスポゾンベクターを用いたBAC transgenesisの改良法確立が当面の目標となる。高効率TG作成方の樹立に成功しており、当初目標は達成できたと判断している。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成２７年度の成果に基づき、平成２８年度は以下の方針で研究を進める。
１）平成２７年度において、これまでに開発してきた損傷応答細胞マーキング系の改変を行ってきた。しかしながら、これらの系を個体に適用する時の問題点として、通常の検出系では初期胚からadultまでの全期間での応答が蓄積され、特定のストレスに対する損傷応答を検出するのが困難である事が明らかになってきた。平成２８年度は、この問題点を克服する系の確立を行う。
２）平成２７年度においてゲノム変異の一部を詳細に解析する系を確立するとともに、変異解析アルゴリズムの構築を行ってきた。これらの成果を基に、平成２８年度には引き続き解析法の改良を行うとともに、様々な損傷応答変異株を用い、各種変異原誘発変異の解析を行う。
３）平成２７年度において、高効率TG作成方の樹立により、組織マーキングの為の新規制御領域を同定でき、また従来の制御領域の改変も行ってきた。平成２８年度は、これら制御領域を用い、１）の系を有効に利用できる体組織多重マーキング系の確立を目指す。
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