| 研究課題/領域番号 |
15H05713
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
藤堂 剛 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (90163948)
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| 研究分担者 |
辻村 亨 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (20227408)
弓場 俊輔 国立研究開発法人産業技術総合研究所, その他部局等, 研究員 (40263248)
瀬々 潤 国立研究開発法人産業技術総合研究所, その他部局等, 研究員 (40361539)
川崎 隆史 国立研究開発法人産業技術総合研究所, その他部局等, 研究員 (60356839)
藤原 智子 (石川智子) 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (70402922)
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| 研究期間 (年度) |
2015-05-29 – 2020-03-31
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| キーワード | 損傷応答 / ゲノム編集 / 突然変異 / 体組織幹細胞 / メダカ |
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| 研究実績の概要 |
我々のゲノムDNAは, 常に、外的・内的要因によるDNA損傷の脅威にさらされている。DNA損傷は「ゲノム不安定性」を誘発し、やがて長期潜伏期の後、発がん等の重篤な疾患をひきおこす。この様な晩発影響の標的細胞として「組織幹細胞」が重要な役割を果たしている。本研究では、「組織幹細胞」に誘発される「ゲノム不安定性」を直接検出するin vitro, in vivo解析系を構築し、環境変異源に対する「組織幹細胞」の損傷応答機構を明らかにする研究を提案している。本年度は、以下の結果を得た。
１）平成２７年度に作成したRev3, CPDphr, 6-4phr, CryDash遺伝子変異体の個体レベル及び培養細胞レベルの解析をおこなった。Rev3に関してはマウスと異なりviableである事が明らかになり、体組織レベルでの詳細な解析が可能になった。またphr関連遺伝子群については，紫外線応答の詳細な解析から、UV損傷修復にはCPFファミリー群の関与を示唆するデータを得た。
２） 全ゲノムおよびキャプチャシーケンスからの正確な変異同定に向け、新たな手法EAGLEを開発した。変異解析に広く利用されているGATKに比べて正確な同定ができることが確認できた。更に、メダカのキャプチャシーケンスに適用し、同定結果をサンガー法とPCRで確認したところ、高精度に変異が検出できていることが確かめられた。
３）メダカ肝および組織幹細胞の可視化及び細胞移植技術確立のための作業をおこなった。その結果、Fabp10aの５'調節領域2kbおよび5kbを用い、肝臓特異的可視化系統を樹立した。組織幹細胞樹立のために、5種のマーカー遺伝子の５'調節領域を用いて、それぞれの可視化系統の樹立を試みており、Bmi1可視化系統をすでに樹立することに成功した。また、メダカ個体への細胞移植技術確立のために、尾静脈から細胞を注入する方法を確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の格子は、１）体組織損傷応答解析系の確立、２）損傷応答をゲノム変異として検出する系の確立、３）新たな組織幹細胞解析系の確立、の３点からなる。
１）に関しては、損傷応答に関わる遺伝子変異体の網羅的変異体作成を行い、得られた変異体(Rev3, CPDphr, 6-4phr, CryDash)の機能解析を行った。目標は充分達成できたと判断している。
２）に間しては、次世代シークエンサー(NGS)による誘発突然変異解析の方法論確立として、新たな手法EAGLEを開発した。従来利用されているGATKに比べて正確な同定ができることが、実際の解析で確認できた。目標は充分達成できたと判断している。
３）に関しては、本申請で必須の技法である組織幹細胞の可視化及びそれを証明する為の細胞移植技術法確立に成功した。当初目標は達成できたと判断している。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成２７、２８年度の成果に基づき、平成２８年度は以下の方針で研究を進める。
１）損傷応答をゲノム変異として検出する方法の確立：平成２７年度より変異解析アルゴリズムの確立及び改変を行ってきた。確立した解析法EAGLEにより、培養細胞系において変異を正確に検出できる事がNGSとキャピラリーシークエンシングの併用により確認できた。今後は、この解析法に更なる改良を加えるとともに、それを利用し、これまでのゲノム解析で明らかになってきた「損傷誘発体細胞組換え」といった新規発見の詳細を明らかにするとともに、そのメカニズム解明を行う。
２）組織幹細胞解析系の確立：これまでの試みにより、マーキング系樹立の目処が立った。また、マーキング体細胞の分取についても技術基盤の整備が整ってきた。今後は、これ等の技術をより利用しやすく改良するとともに、マーキング体細胞からのDNA抽出による体細胞ゲノム解析を行う。
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