| 研究課題/領域番号 |
15H05713
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
藤堂 剛 大阪大学, 放射線科学基盤機構附属ラジオアイソトープ総合センター, 招へい教授 (90163948)
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| 研究分担者 |
辻村 亨 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (20227408)
弓場 俊輔 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (40263248)
瀬々 潤 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 情報・人間工学領域, 招聘研究員 (40361539)
川崎 隆史 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (60356839)
藤原 智子 (石川智子) 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (70402922)
吉村 崇 大阪大学, 放射線科学基盤機構附属ラジオアイソトープ総合センター, 教授 (90323336)
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| 研究期間 (年度) |
2015-05-29 – 2020-03-31
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| キーワード | 損傷応答 / ゲノム編集 / 突然変異 / 染色体異常 / メダカ |
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| 研究実績の概要 |
ゲノムDNAは、外的・内的要因によるDNA損傷の脅威に常に曝されている。DNA損傷は「ゲノム不安定性」を誘発し、長い潜伏期間の後、発がん等重篤な疾患を引き起こす。損傷応答機構はDNA損傷に対抗する生体防御機構であり、ゲノム維持に本質的な役割を果たす。損傷応答研究は、生存率や特定の応答経路への作用を細胞レベルで解析するのがこれまでの常套手段であり、突然変異をそのエンドポイントとする研究はごく少なく、しかも特定遺伝子におこる変異を検出する系が用いられ、ゲノムレベルでの解析はほとんどされていなかった。本申請研究では、ゲノム変異（点突然変異及び染色体レベルでの構造変化）をエンドポイントとして内因性変異因子や環境変異原に対する細胞の損傷応答機構を明らかにする研究を提案している。本年度は以下の研究成果を得た。１）本申請研究においてrev3遺伝子変異体では大腸がんが年齢依存的に全個体で発症する事を見いだした。培養細胞およびがん細胞を対象に、染色体、分子およびゲノムレベルでの解析により発症のメカニズム解明を目指した。培養細胞において①通常の培養条件でDicentric-, Tricentric-, Ring 染色体, クロマチドBreakeなどの染色体異常が高頻度に誘発されること、②ガンマH2AX-fociが高頻度に形成されること、を見出した。以上の結果は、本変異体では二重鎖切断が高頻度に誘発されている事が示している。また、腹腔内に播種しているがん細胞のゲノム解析を行い、③がん細胞で生じている変異を同定するとともに、④がん細胞で生じているSCNAを同定した。２）次世代DNAシークエンサー(NGS)を活用したゲノム変異解析系を樹立し、rev1遺伝子変異体においてDNA損傷によりLOHが高頻度に誘発される事を見いだした。更に、より詳細な解析を行うため単一細胞由来のLOH解析を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本研究の格子は，１）損傷応答機構解析系の確立、２）ゲノム変異解析系の確立，３）体組織レベルでの解析系の確立，の３点からなる。１）に関しては、TALEN, CRISPRのゲノム編集技術によりrev3を含むTLSポリメラーゼや損傷応答制御に関する遺伝子変異体を既に作製し，その表現型解析が順調に進んでいる。２）に関しては、NGSによるゲノム変異解析ツールを確立し、これを用いた解析結果からDNA損傷誘発によるゲノム変異について新たな知見が得られつつある。３）に関しては、幾つかの可視化系統を既に確立している。
この様に、当初計画は順調に進められている。
これに加え、rev3変異体において、年齢依存的に浸透率100%で大腸がんが発症する事を見いだした。ヒト大腸がんに於いては、ミスマッチ修復欠損等による点突然変異（PM）増大が要因となる事が知られているが、これ等はヒト大腸がんの10%程度であり、大部分を占める残りのゲノム変異は染色体レベルでの異常（CIN）であると考えられている。染色体異常を同定するとともに、二重鎖切断DSBの誘発を確認できている。また発がんに関与する遺伝子の同定も進めており、当初予定を超えた成果が得られるものと考えられる
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27－30年度の成果の基づき，平成31年度においては以下の方針で研究を進める。
１）NGSを用いたゲノム解析系を確立し，培養細胞レベルでの解析系から新たな多くの知見が得られつつある。この解析を更に押し進め，ゲノム変異誘発に関与する遺伝子の機能からメカニズム解析を進める。解析法としては、Chip-seqおよびEnd-seq法を用い、一重鎖領域および二重鎖切断場所の塩基レベルでの同定を行う。配列レベルからのメカニズム解明を行う。
２）既に、体組織幹細胞可視化系統をいくつか作製している。平成３０年度から継続して試みている手法であるが、これ等の系統を用い体組織細胞の分取技術の確立を行う。
３）rev3 変異体の大腸がん細胞のゲノム解析を行う。平成３０年度で予備実験を終了しており、本年度はサンプル数をさらに増やした解析を行う。
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