| 研究課題/領域番号 |
15H05775
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
藤吉 好則 名古屋大学, 細胞生理学研究センター, 特任教授 (80142298)
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| 研究分担者 |
大嶋 篤典 名古屋大学, 細胞生理学研究センター, 准教授 (80456847)
阿部 一啓 名古屋大学, 細胞生理学研究センター, 准教授 (60596188)
入江 克雅 名古屋大学, 細胞生理学研究センター, 助教 (20415087)
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| 研究期間 (年度) |
2015-05-29 – 2020-03-31
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| キーワード | 構造生理学 / チャネル / 電子線結晶学 / 単粒子解析 / 膜タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
電子線結晶学を用いて、水チャネルAQP4とその阻害剤AZAとの複合体の構造を3Åの分解能で解析したが、阻害剤の結合様式を確実に観察するには至らなかったので、発現系を改良するところから検討し直して、分解能を2.8Åにまで向上させることによって、阻害剤の結合様式の解明に成功した。
無脊椎動物のギャップ結合チャネル、イネキシンの結晶構造解析を行い、論文を発表したが、分解能が10Åと低い解析しかできなかった。それで、単粒子解析のシステムを立ち上げる努力を行い、界面活性剤を除くGraDeR法も活用して、イネキシンの3.3Å分解能の解析を単粒子解析法を用いて行い、細胞質側の構造を含む立体構造解析に成功した。これらの結果を論文として発表した（Nature Commun, 7, 13681 (2016)）。
さらに、Ｇタンパク質共役型受容体であるヒト由来エンドセリン受容体の構造安定化変異体の作製を行い（JMB, 428, 2265-2274 (2016)）、リガンドであるET-1の結合状態と非結合状態の構造解析に成功して、論文を発表した（Nature, 537, 363-368 (2016)）。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
電子線結晶学を用いて、水チャネルAQP4とその阻害剤との複合体の構造を予定通り3Å分解能で解析したが、阻害剤の結合様式を1義的に決定することは出来なかった。この結晶は、2枚の脂質膜が重なって2次元結晶が形成されているが、阻害剤が結合するとその相互作用が弱くなり、結晶性が悪くなる。それゆえ、さらに高い分解能の構造解析を実現するために、発現系から見直すと共に、極めて多くの電子顕微鏡像と電子線回折像を撮影し、高分解能のデータのみを選別して解析することによって、2.8Åまで分解能を向上させた。これにより、阻害剤の結合様式を決定することが出来て、より良い阻害剤の設計が可能になった。
電位感受性Na+チャネルの選択フィルター部分の変異体を含む構造解析に成功した。また、H+K+-ATPaseの構造解析にも成功している。無脊椎動物由来のギャップ結合イネキシンの構造解析は、チャネルを閉じるN末端を除いた変異体を用いても、高い分解能の構造解析は出来なかった。しかも、野生型の構造は結晶学では解けなかった。しかし、単粒子解析法を用いて、極めて短期間に3.3Å分解能でイネキシンの構造を解析することに成功して、Nature Commun, 7, 13681 (2016)に発表した。さらに、GPCRのリガンド結合型と非結合型の構造を解析して、Nature, 537, 363-368 (2016)に発表した。これらはいずれも、当初の計画以上に進展した結果である。
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| 今後の研究の推進方策 |
単粒子解析法の発展によって、最近の構造生物学をめぐる状況が激変してきている。それゆえ、電子線結晶学やＸ線結晶学を併用しつつも、より単粒子解析に力を入れた研究を進める予定である。
水チャネルの様に、ほとんどが脂質膜内に埋まっている膜タンパク質でも、単粒子解析法を用いて構造解析が出来る方法を開発する。電位感受性Na+チャネルや、H+K+-ATPaseの構造解析は、基本的には結晶学を用いて行う。
単粒子解析によるイネキシンの構造解析に引き続いて、脊椎動物由来のコネキシンの構造を、単粒子解析法を用いて行う予定である。また、新たに開発している低温電子顕微鏡とIBSA法を用いて、脂質膜内にある膜タンパク質の構造解析を行う。
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