マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食と細胞膜の非対称性

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15H05785
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 長田 重一 大阪大学, 免疫学フロンティア研究センター, 寄附研究部門教授 (70114428)
• 研究期間 (年度): 2015-05-29 – 2020-03-31
• キーワード: アポトーシス / 自然免疫 / リン脂質 / マクロファージ / 貪食

研究実績の概要

アポトーシスを起こした細胞はフォスファチジルセリン(PtdSer) を "eat me" シグナルとして提示し、マクロファージによって貪食される。私達は、死細胞の貪食に関与する分子(Tim4, MER, MFG-E8)を同定するとともに、PtdSerを細胞膜の内膜と外膜の間でスクランブルさせる分子（スクランブラーゼ, Xkr8とTMEM16F）、外膜から内膜へ移動させる分子 (フリッパーゼ, ATP11C)を同定してきた。本研究はこれら分子の作用機序、生理作用を明らかにすることを目的としている。
本年度は、Ca2+ によって活性化されるスクランブラーゼTMEM16F（１０個の膜貫通領域を持つタンパク質）はホモ２量体として存在し、Ca2+ が直接その膜貫通領域（第VI-VIII番目の貫通領域）に存在する５個のグルタミン酸やアスパラギン酸残基に結合、そのコンフォメーションを変化させることを見出した。一方、同じように１０個の膜貫通領域を持つXKR8 スクランブラーゼが細胞膜に局在するためにはIgGファミリーに属するタイプI膜タンパク質Basigin(BSG) あるいはNeuroplastin(NPT) が必要であり、細胞膜上でこれらのどちらかと1:1の複合体を形成していることを見出した。アポトーシスを起こした細胞ではXkr8はそのC-末端部位でカスパーゼによって切断、Xkr8-BSG/NPTはヘテロ４量体となり、スクランブラーゼとして作用する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

スクランブラーゼの活性化機構に関して研究はほぼ順調に推移した。TMEM16FはCa2+に依存して作用するスクランブラーゼではあるがCa2+結合能は弱くCa2+によって直接活性化されるか、Ca2+が結合する他の分子と会合しているか不明であった。私達はこの分子を精製、TMEM16Fはホモ２量体として存在することを見出した。一方、その精製過程でTMEM16FはCa2+が存在しない溶液中ではaggregationすることを見出した。そこで、Ca2+が結合すると考えられるAsp, Glu残基に網羅的に変異を導入、Ca2+存在下でもaggregationする変異を同定、膜貫通領域に存在する5個のアミノ酸残基をCa2+結合部位と同定した。実際、これら残基に変異を持つタンパク質はそのスクランブラーゼ活性を完全に失った。

一方、Xkr8は膜を可溶化するdetergentの種類によってBlue-Native PAGE での挙動が大きく異なることに気がついた。すなわち、digitoninなどのmildなdetergent の存在下では250kDa、Triton X100などの強いdetergent では140 kDaのタンパク質として挙動した。そこで、Flag-tagged Xkr8発現細胞の膜分画をdigitoninで可溶化、Xkr8複合体を抗Flag抗体に吸着、会合しているタンパク質をTriton X100を用いて 解離させ、MS解析を行った。その結果Xkr8はBSGあるいはNPTと２量体を形成していることが判明した。ついでBSG、NPTをノックアウトした細胞を樹立したところ、Xkr8は細胞膜に局在せずERに蓄積した。このことからBSG/NPTはシャペロンとしてXkr8を細胞膜にエスコートすると結論した。

以上の結果はBiochemistry、およびPNAS に２方の論文として発表した。

今後の研究の推進方策

スクランブラーゼは非特異的にリン脂質を細胞膜の内層と外層の間で輸送する。私達はこれまでにTMEM16Fによく似たアミノ酸配列を持つTMEM16EはERに局在するためにその活性が不明であるが、膜貫通領域IV-Vに渡る35個のアミノ酸を細胞膜に局在し、Cl-チャネルとして作用するTMEM16Aの対応する部分と置換するとスクランブラーゼの活性を示すことからこの分子はERでのCa2+依存スクランブラーゼと結論した。TMEM16にはそのほかにTMEM16H や16K が存在することからこれらの対応する領域をTMEM16Aに導入、スクランブラーゼ活性を持つかどうか検討する。また、ATP11Cのシャペロンとして作用するCDC50AがATP11Cのフリッパーゼ活性に必要かどうかCDC50Aに種々の変異を導入することにより検討する。一方、マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食にはPtdSerに対する受容体として作用するTim4、チロシンキナーゼ受容体であるTAM family タンパク質（Tyro3、AxlおよびMer）が関与しているが貪食におけるこれら分子の関係を生化学的に解析する。また、Tim4、TAM受容体のマクロファージを同定するとともにこれらマクロファージがアポトーシス細胞を貪食するに際し、Tim-4、TAM受容体の要求性を明らかにする。

研究成果

• [国際共同研究] Wellcome Trust-MRC Inst of Metabolic Sci(英国)
  • 国名: 英国
  • 外国機関名: Wellcome Trust-MRC Inst of Metabolic Sci
• [国際共同研究] National Yang-Ming University(台湾)
  • 国名: その他の国・地域
  • 外国機関名: National Yang-Ming University
• [国際共同研究] Tytgat Inst for Liver and Intestinal Res(オランダ)
  • 国名: オランダ
  • 外国機関名: Tytgat Inst for Liver and Intestinal Res
• [国際共同研究] New Jersey Medical School/Cincinnati Children's Hospital Res Found(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: New Jersey Medical School/Cincinnati Children's Hospital Res Found
• [国際共同研究] Heidelberg University(ドイツ)
  • 国名: ドイツ
  • 外国機関名: Heidelberg University
• [国際共同研究]
  • 他の国数: 1
• [雑誌論文] Cardiac myofibroblast engulfment of dead cells facilitates recovery after myocardial infarction. (2017)
  • 著者名/発表者名: Nakaya, M., Watari, K., Tajima, M., Nakaya, T., Matsuda, S., Ohara, H., Nishihara, H., Yamaguchi, H., Hashimoto, A., Nishida, M., Nagasaka, A., Horii, Y., Ono, H., Iribe, G., Inoue, R., Tsuda, M., Inoue, K., Tanaka, A., Kuroda, M., Nagata, S. and Kurose H.
  • 雑誌名: J. Clin Invest. 巻: 127 ページ: 383-401
  • DOI: 10.1172/JCI83822
  • 査読あり
• [雑誌論文] Role of Ca2+ in the Stability and Function of TMEM16F and 16K. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ishihara, K., Suzuki, J. and Nagata, S.
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 55 ページ: 3180-3188
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.6b00176
  • 査読あり
• [雑誌論文] Xkr8 phospholipid scrambling complex in apoptotic phosphatidylserine exposure. (2016)
  • 著者名/発表者名: Suzuki, J., Imanishi, E. and Nagata, S.
  • 雑誌名: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 巻: 113 ページ: 9509-9514
  • DOI: 10.1073/pnas.1610403113
  • 査読あり
• [雑誌論文] Osteopontin in Spontaneous Germinal Centers Inhibits Apoptotic Cell Engulfment and Promotes Anti-Nuclear Antibody Production in Lupus-Prone Mice. (2016)
  • 著者名/発表者名: Sakamoto, K., Fukushima, Y., Itoh, K., Matsuda, M., Nagata, S. Minato, N. and Hattori, M.
  • 雑誌名: J. Immunol. 巻: 197 ページ: 2177-2186
  • DOI: 10.4049/jimmunol.1600987
  • 査読あり
• [雑誌論文] Exposure of Phosphatidylserine on the Cell Surface. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nagata, S., Suzuki, J., Segawa, K. and Fujii, T.
  • 雑誌名: Cell Death Differ. 巻: 23 ページ: 952-961
  • DOI: 10.1038/cdd.2016.7
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cell biology: Killer enzymes tethered. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nagata, S.
  • 雑誌名: Nature 巻: 533 ページ: 474-476
  • DOI: 10.1038/nature18439
  • 査読あり
• [学会発表] Exposure of Phosphatidylserine to the Cell Surface. (2017)
  • 著者名/発表者名: Nagata, S.
  • 学会等名: 【Keynote address】EMBO Workshop on "Cell death, inflammation, and cancer", Innsbruck University Conference Center, Obergurgl, AUSTRIA
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Asymmetrical Distribution of Phospholipids at Plasma Membrane, and Exposure of Phosphatidylserine to the Cell Surface. (2017)
  • 著者名/発表者名: 長田 重一
  • 学会等名: 【会長特別企画講演】第81回日本循環器学会学術集会 ANAクラウンプラザホテル金沢 金沢
  • 招待講演
• [学会発表] Exposure phosphatidylserine in apoptotic cell death, and engulfment of dead cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nagata, S.
  • 学会等名: The International Meeting on "Cell Death, Inflammation and Immunity", Creta Maris Beach Resort, Creta, GREECE
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Scramblases and Flippase at Plasma Membrane. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nagata, S.
  • 学会等名: Meeting-workshop on Chorea-Acanthocytosis & Vesicular-Vacuolar Transport, University of Michigan, Michigan, USA
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Exposure of phosphatidylserine to the cell surface. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nagata, S.
  • 学会等名: The 3rd Nobel Conference entitled “The Cell Cycle and Cell Death in Disease”, Karolinska Institutet, Stockholm, SWEDEN
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Exposure of Phosphatidylserine to the Cell Surface. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nagata, S.
  • 学会等名: RIKEN IMS Summer Program (RISP 2016), RIKEN-IMS, Yokohama, JAPAN
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Exposure of Phosphatidylserine to the Cell Surface. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nagata, S.
  • 学会等名: The RIKEN IMS-JSI International Symposium on Immunology 2016, Pacifico Yokohama, Yokohama, JAPAN
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Molecular Mechanism of Apoptotic Phosphatidylserine Exposure. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nagata, S.
  • 学会等名: The 2016 Gordon Research Conference on Cell Death, PGA Catalunya Business and Convention Centre, Girona, SPAIN
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Flippase and Scramblase that regulate phospholipid distribution at plasma membrane. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nagata, S.
  • 学会等名: 【Keynote address】The 26th International Complement Workshop, Hotel Nikko Kanazawa, Kanazawa, JAPAN
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Exposure of Phosphatidylserine to the Cell Surface. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nagata, S.
  • 学会等名: 【Keynote address】The 2016 CSI Congress on Immunology, Hefei Fengda International Hotel, Hefei, CHINA
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Apoptosis and exposure of phosphatidylserine. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nagata, S.
  • 学会等名: The 30th Anniversary Symposium of IMB, Academia Sinica, Taipei, TAIWAN
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Exposure of Phosphatidylserine to the Cell Surface. (2016)
  • 著者名/発表者名: 長田 重一
  • 学会等名: 【特別講演】第68回日本細胞生物学会大会 京都テルサ 京都
  • 招待講演
• [学会発表] アポトーシスの分子機構の解明とその生理作用 (2016)
  • 著者名/発表者名: 長田 重一
  • 学会等名: 【特別シンポジウム】第75回日本癌学会学術総会 パシフィコ横浜 横浜
  • 招待講演
• [学会発表] 細胞膜の非対称性とその崩壊 (2016)
  • 著者名/発表者名: 長田 重一
  • 学会等名: 【特別講演】第66回日本薬学会近畿支部総会・大会 大阪薬科大学 大阪
  • 招待講演
• [学会発表] Structural analysis of a phospholipid scramblase (2016)
  • 著者名/発表者名: 櫻木崇晴、長田重一
  • 学会等名: 第45回日本免疫学会学術集会 沖縄コンベンションセンター 沖縄
• [図書] スクランブラーゼによるホスファチジルセリンの露出「実験医学」Vol.34, No.7(増刊), 68-73頁 (2016)
  • 著者名/発表者名: 鈴木淳、長田重一
  • 総ページ数: 205
  • 出版者: 羊土社
• [図書] リン脂質フリッパーゼとアポトーシス細胞の認識「実験医学」Vol.34, No.7(増刊), 74-80頁 (2016)
  • 著者名/発表者名: 瀬川勝盛、長田重一
  • 総ページ数: 205
  • 出版者: 羊土社
• [備考] 長田重一研究室
  • URL: http://biochemi.ifrec.osaka-u.ac.jp/