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アルツハイマー病発症初期に病理像が出現する成体マウス脳の嗅内野と海馬における神経細胞を単離する手技を検討し、アルツハイマー病発症早期に起こっている神経細胞内変化を見出す事を目的とする。申請者は本研究計画の開始以前に、海馬CA1錐体神経細胞の単離法は確立していた。本研究では、嗅内野の第2/3層の神経細胞を単離するため、以下の実験を行った。
実体顕微鏡下で嗅内野の第2/3層は目視で確認が出来ないため、蛍光標識の逆行性トレーサーを海馬領域へインジェクションすることを考えており、そのための試薬の購入と手技の習得を行った。トレーサーのインジェクションは、名古屋市立大学・医学部へ行き、実験手順を習得した。
次に、脳組織からの神経細胞単離法を検討した。当研究室の保有機器の関係で、単離法は以前と比べ大きくプロトコールを変更した。野生型成体マウス脳組織を取り出し、Tissue Chopperにて約500μm厚さのスライス片を調製し、実体顕微鏡下で嗅内野第2/3層付近を微小切除し、酵素処理を行った。神経突起を含む分散した神経細胞を得ることが出来たため、これらの単一神経細胞をマイクロピペットで拾い、単一神経細胞cDNAライブラリーの調製を行った。これらのcDNAライブラリーを用いてRT-PCRを行ったところ、嗅内野の第2/3層特異的なマーカー遺伝子（Oxr1やCalbindin1など）の発現を確認した。一方、発現量が低い、若しくは逆転写がされにくい遺伝子（Relnなど）については、RT-PCRによる増幅がみられず、新プロトコールの改善の必要が出てきた。
本研究計画で施行した手法を用いる事で、モデルマウスでの単一神経細胞特異的なトランスクリプトーム解析が可能になるものと考えられる。
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