|
前年度に作成したDNAメチル化制御タンパク質とDNA切断酵素を不活性化したdead Cas9タンパク質との融合タンパク質発現ウイルスべクターを用いて、DNAメチル化変化をDNA配列特異的を誘導できるか検証を行った結果、DNAメチル化変換効率が高くなかったため。本年度は、核移行シグナルの付加によって、変換効率の上昇がみられるのかバイサルファイトパイロシーケンス法により検証した。その結果、変換効率の上昇は確認できたものの、実験結果が安定せず、十分な再現性が得られなかった。
問題点を検証するうち、dCas9-DNAメチル化酵素融合タンパクと薬剤選択マーカー、ドキシサイクリンを同時発現させた場合、レンチベクターコンストラクトの大きさが原因となり、細胞内に導入されたコンストラクトが十全に機能していないこと可能性が示唆された。
そのため、コンストラクトサイズの縮小とさらなる変換効率の上昇を図るため、群馬大学の畑田研究室と共同研究を行い、畑田研究室で構築されているdCas9と微小ペプチド抗体（Suntagシステム）を用いたエピゲノム編集技術を申請者のシステムを組合せ、DNAメチル化酵素タンパクとdCas9タンパクを別々のレンチウイルスベクターに再構築しなおし、検証を行った結果、エピゲノム変換を効率よくひきおこすことができることを確認した。さらに分割することにより、レンチウィルス感染効率が大きく上昇し、実験ツールとしての利便性を大きく上昇させることに成功した。
|
