EGF受容体および不良ミトコンドリアにおけるユビキチン修飾の実体解明

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15H06882
• 研究機関: 公益財団法人東京都医学総合研究所
• 研究代表者: 土屋 光 公益財団法人東京都医学総合研究所, 生体分子先端研究分野, 研究員 (90760132)
• 研究期間 (年度): 2015-08-28 – 2017-03-31
• キーワード: タンパク質分解

研究実績の概要

ユビキチンによるタンパク質の翻訳後修飾は、タンパク質分解のみならず、シグナル伝達や、タンパク質の輸送など広汎な生命機能を制御することが明らかとなってきた。ユビキチン修飾が多彩な機能を発揮することを可能としているのがユビキチン修飾の構造多様性である。ユビキチン修飾の構造は、「ユビキチン鎖の種類」、「長さ」、「翻訳後修飾」、「複雑さ」の4つの要素から成り立つ。本研究では、申請者が開発したユビキチン鎖長決定法および質量分析計によるユビキチン鎖の高感度絶対定量法を用いて、2つの重要なユビキチン依存的経路（1）増殖因子受容体のダウンレギュレーションと（２）マイトファジー（ミトコンドリアのオートファジー分解）に焦点を当て解析することで、同経路におけるユビキチンシグナルの実体とデコーティング機構を時空間的に解明することを目的とする。EGFRや損傷ミトコンドリアのユビキチン化について既に数多くの報告があるが、研究者ごとに異なる結果であり、混沌としているのが現状である。その要因としてユビキチン鎖の種類のみ注目されてきた経緯が挙げられる。本研究は、申請者自身が開発したユビキチン修飾解析法により、EGFRおよび損傷ミトコンドリアに提示されるユビキチンシグナル（ユビキチン鎖の長さなどを含めたユビキチン修飾の全ての情報）を時空間的に解析する。本年度はEGF依存的にEGFRに付加されるユビキチン鎖の種類を明らかとした。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

EGFRはEGF刺激により数分の間にポリユビキチン化され、エンドサイトーシスにより取り込まれた後、リソソームまで運ばれ分解される。一方、エンドサイトーシスされたEGFRの一部は脱ユビキチン化酵素USP8によりユビキチン鎖が除去され再び細胞膜に局在化する（Mizuno et al, Mol Cell Biol, 2005）。先行研究によりEGFRはK11、K48、K63鎖型のユビキチン修飾を受けることが報告されている（Huang, F et al, Mol Cell, 2006）が、鎖の種類と長さの関係については依然不明である。そこでFLAGタグ融合EGFR発現細胞を作製し、EGF刺激依存的に付加されるユビキチン修飾の種類を検討した。この結果、ＥＧＦ刺激依存的にEGFRは主にモノユビキチン化およびK63鎖が付加されていることが明確となった。

今後の研究の推進方策

現在までに解析のすすんでいるEGFRに焦点をあて解析を進めていく。EGF刺激後、EGFRを免疫沈降し、Ub-ProT法によりEGFRに付加されたユビキチン鎖の鎖長情報を得る。次いで、Ub-PRM法により各長さのユビキチン鎖にどのようなタイプのユビキチン鎖が含まれるか解析する。次いで、経時的に解析することで、EGFRに付加されるユビキチン修飾の変動を生化学的にモニターする。一方、USP8のノックダウン時、リソソーム阻害時において同様に解析する。ノックダウン実験と並行して阻害剤を用いた解析も並行して行う。

研究成果

• [学会発表] プロテアソーム依存的タンパク質分解経路におけるユビキチン鎖選択制の解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 土屋 光、吉原英人、新井直子、海保愛、田中啓二、佐伯泰
  • 学会等名: 第38回 日本分子生物学会 第88回 日本生化学会合同大会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド (兵庫県神戸市)
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04