研究課題
＜平成27年度研究実施状況＞レム睡眠の異常をもたらす新規遺伝子Dreamless、CRISPR/Casシステムを用いた変異の再現目的と方法）本研究の開始より以前、すでにDreamless変異マウスにおける候補遺伝子および塩基配列変異部位が染色体連鎖解析と次世代シークエンシングにより同定されていた。通常、フォワードジェネティクス研究で候補遺伝子が見出され、その表現型が優性遺伝だった場合、同様の遺伝子変異を導入したマウスを作製し、同じ表現型を示すかどうかを確認することで、原因遺伝子かどうかを確定することができる。また今回は、化学変異原ENUで遺伝子変異がランダムかつ複数導入されているため、同一染色体内の他の遺伝子にも変異が残存している可能性が残されていた。そこで、CRISPR/Casシステムを用いて候補遺伝子のみに特異的に変異導入することでDreamless変異マウスを再現し、Dreamless遺伝子変異と表現型の因果関係を確定する実験を計画した。すなわち、本研究におけるDreamless家系と同様のレム睡眠異常が認められるかどうかを、個体レベルで最新のゲノム編集技術により迅速に検討することを試みた。結果）Dreamless変異マウスにおける原因遺伝子の証明Cas9タンパクとガイドRNAをコードするプラスミドベクターおよび変異導入の鋳型となる一本鎖DNAをマウス胚に同時微小注入することで、Dreamless特異的遺伝子改変アリルを持つマウス個体の作成に成功し、この変異アリルが遺伝性を有することも確認した。このヘテロ変異個体を用いて、脳波筋電図測定（EEG/EMG recording）により睡眠覚醒行動様式について解析した結果、ENU由来のDreamless変異マウスと同じレム睡眠時間減少の表現型を示すことがわかった。すなわち、Dreamless遺伝子がレム睡眠異常の原因遺伝子であることを直接証明し、本研究におけるレム睡眠異常と原因遺伝子変異部位との因果関係を確定することができた。
2: おおむね順調に進展している
平成27年度における本研究課題の進捗状況は、おおむね期待通り順調に進展しているといえる。1年目の当初の予定どおり、Dreamless変異マウスにおける原因遺伝子について、CRISPR/Casシステムを用いた変異アリルの再現により確定することができた。また、脳波筋電図測定により得られた各種データの詳細な解析から、レム睡眠様式における異常だけでなく、覚醒やノンレム睡眠の様式においても、野生型のそれと比較して顕著に変化している部分を見出すことができた。特に、得られた脳波筋電図データに対してFFT（Fast Fourier Transform）により周波数領域のデータに変換を行い、その周波数領域データの主成分分析を行った結果、ノンレム睡眠時やレム睡眠時に生じる徐波について変化している様子を観察できたのは意外であった。さらに、ViewRNA ISH法と呼ばれる感度の高い特殊なin situハイブリダイゼーション法の導入を試み、成体期野生型マウスにおけるDreamless遺伝子を発現する細胞の神経領域内の分布についても同定することができた。以上より、レム睡眠が減少する表現型の原因遺伝子の確定、その遺伝子の発現パターンについての知見が得られたことにより、本年度の研究実施計画における当初の目的は達成できた。
本年度、本研究課題で主な研究対象として用いたレム睡眠異常の表現型を呈するDreamless変異マウスにおいて、レム睡眠の異常を誘導する遺伝子変異を同定し、その遺伝子変異を野生型マウスに対してCRISPR/Casシステムにより人工的に導入することで、同様の表現型を再現することにより原因遺伝子の確定ができた。すなわち、睡眠研究分野における新規睡眠関連遺伝子を同定することに成功した。今後は、どのようにしてDreamlessマウスに特徴的な睡眠覚醒様式の変化が現れるのか、新たなDreamless遺伝子改変マウスを用いた脳へのウイルスベクター注入実験によって、その原因を明らかにしていきたい。本年度の研究過程において、共同研究として筑波大学の生命科学動物資源センターとのDreamless-floxノックインマウス作成実験も平行して進んでいることから、平成28年度の秋頃にはCreリコンビナーゼタンパクを強制的に発現させるウイルスベクターを用いた、脳内局所微量投与によるloss-of-function実験も開始できることが期待される。これにより、神経領域特異的にDreamless遺伝子を欠失させることが可能となり、Dreamless遺伝子がレム睡眠を制御する神経回路において、いったいどの部分で機能しているのかを明らかにできる可能性がある。ウイルスベクター注入部位の選定については、Dreamless遺伝子の脳内発現パターンを調べたin situハイブリダイゼーション実験から得られた情報より、特に顕著に発現が強い領域を優先的に候補に挙げ、その中でもこれまでレム睡眠制御と関連があると報告されている脳部位をターゲットにする予定である。
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Elife
巻: Apr 13;4 ページ: No info
doi: 10.7554/eLife.07051
