| 研究課題/領域番号 |
15J00393
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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| 特別研究員 |
藤山 知之 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 特別研究員(PD)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-24 – 2018-03-31
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| キーワード | NALCN / REM Sleep / ENU / CRISPR / Central Neuvous System / Mouse / EEG/EMG Recording / Dreamless |
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| 研究実績の概要 |
レム睡眠異常の原因遺伝子産物NALCNの機能について、Dreamless遺伝子変異がどのような影響を及ぼすかを培養細胞と脳スライスを用いて電気生理学的に調べ、またDreamless変異マウスについて行動生理学的実験を行い、記憶形成や概日リズム強度に変化がみられることを明らかにした。これらの結果は論文として報告した（Funato, Fujiyama et al., 2016 Nature）。さらに、CRISPR/Cas9システムを活用し、loss-of-function実験のためのNalcn-floxノックインマウス系統の作製を試み、in vitroおよびin vivoの系を用いた活性確認を経て、年度内に系統作製が完了した。一方、Dreamless変異マウスにおけるレム睡眠異常の原因となる神経領域および神経細胞探索のためのNalcn-FLExノックインマウス系統の作成にも取り組み、１度目の作製では目的の遺伝子組み換えが誘導されなかったため、繰越申請を行い、改変する遺伝子構造を見直し、異なる動物種の遺伝子配列を導入することで検出の改善方法を検討した上で、改めてDreamless-FLExマウスの作製を試み、この系統を樹立した。
平成28年度補助事業にて施行した主な研究の概要を以下に示す。
（1）Dreamless変異マウスにおける原因遺伝子産物NALCNの野生型および変異タンパクの電気生理学的機能解析
（2）Dreamless変異マウスにおける記憶形成および概日リズムの行動生理学的解析
（3）Nalcn遺伝子に対するloss-of-function実験のためのNalcn-floxノックインマウスの作製
（4）Nalcn遺伝子に対するgain-of-function実験のためのNalcn-FLExノックインマウスの作製
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成28年度における本研究課題の進捗状況は、当初の予定よりやや遅れている。その理由として、研究に際しての事前調査の困難が生じたためである。本研究は、レム睡眠の神経基盤、特にレム睡眠の恒常性制御について明らかにすることを目的としている。申請者が所属する研究室では、レム睡眠量が顕著に減少するDreamless変異マウスの樹立に成功し、その原因遺伝子として電位非依存性イオンチャネルをコードするNalcnを同定した。Dremalessマウスにおいては変異型NALCNが全身性に発現するため、Cre-loxPシステムを用いて脳部位特異的に変異型NALCNを発現することが期待される"Nalcn-FLEx"という遺伝子改変マウス系統の作製を試みた。しかしながら、平成28年10月頃、全身性にCreを発現する系統と組み合わせても、当初の予想に反してレム睡眠の減少が睡眠解析で検出されず、またmRNA抽出、逆転写のちPCR、シークエンスなどの解析により目的の遺伝子組み換え現象がみられるか検討したところ、やはり目的とする組み替え配列が検出できないことが判明した。このため、改変する遺伝子構造の見直し、異なる動物種（ラット）の遺伝子配列を導入し検出過程の改善方法を検討した上で、改めてNalcn-FLExマウスを作製する必要が生じた。それに伴い、当該年度に予定していた脳波測定などのデータ取得は次年度に持ち越しとなった。
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| 今後の研究の推進方策 |
Dreamless変異マウスにおけるレム睡眠異常の原因となる神経領域および神経細胞探索のためのNalcn-FLExノックインマウス系統の再作製に取り組み、目的の遺伝子組み換えの誘導を確認するなど、次年度内での系統作出の完了を予定している。これを用いて、睡眠データ取得のための脳波測定および解析などの実験も施行する。
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