| 研究課題/領域番号 |
15J00686
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
平野 港 北海道大学, 獣医学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-24 – 2018-03-31
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| キーワード | フラビウイルス / 人獣共通感染症 / ウイルス複製 / 神経機能 / RNA輸送 |
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| 研究実績の概要 |
神経突起形成を形成させたPC12細胞に、ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)を感染させ、間接蛍光抗体法および蛍光in situハイブリダイゼーション法により、ウイルスタンパク質およびウイルスゲノムの検出を行った。結果、神経突起上にウイルスタンパク質、およびゲノムRNAが検出され、PC12細胞において神経突起へとウイルスゲノムRNAが輸送されていることが示された。
ウイルスゲノムの輸送様式として、以下の３つが考えられる。1. ウイルス粒子中にパッケージングされて輸送される。2．ウイルスゲノムと非構造タンパク質で形成されるRNA複製複合体として輸送される。3. ウイルスタンパク質非依存性にウイルスゲノムRNA単体で輸送される。そこで、TBEVのウイルスゲノムRNAを発現するプラスミドを作出し、PC12細胞において輸送機序の解析を行った。まず、タンパク質翻訳領域 (CDS) 中からウイルス粒子を形成するタンパク質をコードする部位を欠損させたプラスミドをPC12細胞へと導入し、ゲノムRNAの分布を観察した。ウイルスゲノムは変わらず神経突起へと分布し、ウイルス粒子の形成は不要であることが示された。次にCDSのタンパク質翻訳開始コドンに変異を導入し、すべてのウイルスタンパク質発現能力を欠く変異ゲノムRNAを発現するプラスミドを構築し、観察を行った。結果、ウイルスゲノムRNAは変わらず観察され、ウイルスゲノムの輸送にウイルスタンパク質は関与しないことが示された。
これまでの結果により、ウイルスタンパク質は輸送に関与しないことが示されたため、CDSの大部分を欠損させたゲノムRNAを発現するプラスミド(pCMV-Oshima REP dCDS)を構築し、輸送の観察を行った。結果、輸送は変わらずに観察され、TBEVはゲノムの非翻訳領域に輸送の為のシグナルを持つことが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
先の年度の研究においては、PC12細胞および、ウイルスゲノムRNAを用いて、フラビウイルスのゲノム輸送の為のウイルス因子として、ウイルスゲノムRNAの非翻訳領域、UTRが重要であることが示された。また、それらの成果は日本ウイルス学会、分子生物学会などの国内学会において発表された。これは概ね一年目の計画であるウイルス因子の同定を満たすものであると言える。フラビウイルスゲノムRNAの非翻訳領域、UTRの機能は未解明であり、本研究によりその機能解明に新たな知見をもたらすことが期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
先年度の研究により、ウイルス因子の同定が行われたため、今後は当初の予定通り、宿主因子の同定を行う。近年、神経細胞は特定のmRNAを神経突起へと輸送し、局所的にタンパク質生産を行うことにより、神経機能の恒常性を維持するNeuronal Granuleと呼ばれる構造体をもつことが示されている。輸送される宿主のmRNA中のシグナル配列は非翻訳領域、UTRに存在することが示されているが、詳細については未知の点が多い。先の年度において、ウイルスゲノムRNAの輸送シグナルとしてUTRの関与が示されたが、ウイルスゲノム輸送とNeuronal GranuleによるmRNAの輸送には共通点があり、ウイルスはこの機構を利用している可能性がある。今年度は輸送の為の宿主因子として、Neuronal Granuleに着目し、検討を行う。具体的には神経細胞における共局在解析、免疫沈降法によるNeuronal Granuleとウイルスゲノムの相互作用の確認を行う。
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