| 研究課題/領域番号 |
15J00743
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
真島 剛史 大阪大学, 工学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-24 – 2018-03-31
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| キーワード | ヘムタンパク質 / 亜鉛ポルフィリン / 人工光捕集系 / タンパク質再構成 / 光増感色素 / エネルギー移動 |
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| 研究実績の概要 |
天然の光化学系は太陽光エネルギーを利用して効率的に光反応を行っている。中でも、光捕集系は、エネルギー密度の極めて低い太陽光エネルギーを用いて、多電子を必要とする酸化還元反応を実現するためのアンテナ部分である。これまでに我々は、人工光捕集系の構築を指向し、環状六量体ヘムタンパク質(HTHP)を素材として、光増感色素である亜鉛ポルフィリン(ZnPP)の環状集積化を達成している。また、集積化されたZnPP間でのエネルギー移動についても報告している。
本年度は、天然の光捕集系が幅広い波長領域の光を吸収し、一箇所に集約することに注目し、より再現度の高いモデル構築を指向して、HTHP内に集積化されたZnPPに対してドナーまたはアクセプターとなる色素を導入した。具体的には、ドナー色素としてフルオレセインを、アクセプター色素としてTexas Redを選択し、マレイミドとチオールのカップリング反応により、HTHPマトリックスへ導入した。さらに、HTHPの持つヘムを再構成法によりZnPPに置換し、６分子のZnPP、5分子のフルオレセイン、1分子のTexas Redが集積化されたタンパク質((Flu)5-Tex-rHTHPZnPP)を得た。(Flu)5-Tex-rHTHPZnPPにおいて、フルオレセイン及びZnPPから、Texas Redへのエネルギー移動が確認されたことから、本系が幅広い可視光領域の光を吸収し、一箇所に集約可能な光捕集系であることが示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでに、人工光捕集系構築の基盤として、環状六量体ヘムタンパク質(HTHP)を用いることで、光増感色素の環状集積化を達成している。
本年度は、天然の光捕集系が幅広い波長領域の光を吸収することに注目し、 より高い光捕集能を持つ系の構築を志向して、HTHP内に集積化されたZnPPに対してドナーまたはアクセプターとしてフルオレセインとTexas Redを導入した。
具体的には、システインを導入したHTHPを、組み換え大腸菌を用いて発現し、イオン交換カラムを用いて精製を行い、得られたHTHPを、DTTを用いて還元した。還元後、酸化剤を用いてジスルフィドダイマーHTHPを調製、サイズ排除カラムを用いて精製を行い、フルオレセインを導入した。過剰のフルオレセインを取り除いた後、DTTを用いて、ジスルフィド結合を切断し、Texas Redを還元したチオール基へ結合した。過剰のTexasRedをサイズ排除カラムにより除去し、フルオレセイン5分子とTexasRed 1分子が結合したHTHP ((Flu)5-Tex-HTHP)を得た。次に、酸性条件下で2-ブタノンを用いて、(Flu)5-Tex-HTHPのヘム分子を抽出し、透析により中和した後にZnPPを挿入することで、ZnPPを含む再構成タンパク質 ((Flu)5-Tex-rHTHPZnPP)を得た。
蛍光スペクトル並びに、励起スペクトル測定から、フルオレセインとZnPPから、1分子のTexas Redへのエネルギー移動を確認した。すなわち、(Flu)5-Tex-rHTHPZnPPが幅広い可視光領域の光を捕集可能な光捕集系であることが示された。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに、環状六量体ヘムタンパク質を素材とした、異種色素集積化タンパク質(Flu)5-Tex-rHTHPZnPPの調製を達成している。今後は、(Flu)5-Tex-rHTHPZnPPにおける、色素間エネルギー移動について、より詳細な知見を得るために、蛍光量子収率測定等の光化学測定を実施する。
また、昨秋にアイントホーフェン工科大学(オランダ)のBrunsveld教授のもとに3ヶ月間留学し、DNAを用いた集合体の構築法を学んだ。この技術を応用し、蛍光タンパク質を組み合わせた新規光捕集系の構築にも取り組む予定である。具体的には、HTHP表面へ、共有結合的にssDNAを導入する。さらに、対となるssDNAを導入した蛍光タンパク質を調製し、混ぜ合わせることで、１つのHTHPに対して、複数の蛍光タンパク質が集合化した系の構築を試みる。
また、同様の手法を用いて、HTHPを平面上に2次元的に集積化させることで、大規模な光捕集系の構築を目指す。
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