腸管上皮－間質ニッチの包括的理解と自己補完的組織培養技術の確立

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15J00981
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 杉本 真也 慶應義塾大学, 医学研究科, 特別研究員(DC1)
• 研究期間 (年度): 2015-04-24 – 2018-03-31
• キーワード: オルガノイド / 腸管上皮幹細胞 / 炎症性腸疾患 / 粘膜再生治療 / 間質細胞

研究実績の概要

今年度は，in vitro系における間質細胞ニッチの検討に基づく理解から昨年度成功に至った，免疫不全マウスにおけるヒトオルガノイド同所異種移植，および大動物における内視鏡的なオルガノイド自家移植系のさらなる最適化を行った．
移植細胞においては，培地の無血清化のため，Wnt-3aを無血清Wntタンパク質複合体に置換し，また，効率的に大量の細胞を培養する手法の開発に成功した．レシピエントマウスにおいては，EDTAによる腸管上皮欠損モデルを改良することにより，生存率および生着率を向上させ，同所異種移植系を安定化することに成功した．これらの手法の改変により，ヒト腸管上皮オルガノイド（正常細胞および腫瘍細胞）の広範な同所異種移植の長期生着を達成した．正常オルガノイドは腫瘍化せず半年以上生着することを内視鏡下での経時的観察において確認できたのに対し，コントロールとして用いた腫瘍オルガノイドでは，腫瘍の経時的な増大が確認できた．これまで，間質との共移植によって移植効率化を図ることを目指してきたが，移植手法の改良により腸管上皮オルガノイド単独での効率的な同所異種移植が達成され，レシピエントとなるマウスの間質細胞から供給されるニッチ因子によって，ヒトのドナー幹細胞がマウス腸管内に生着しうることが明らかとなった．さらに，移植オルガノイドに対してCRISPR/Cas9による遺伝子改変技術を用いて，ヒト腸管上皮幹細胞マーカーであるLGR5の機能的な存在確認を行った．また，マイクロミニピッグの腸管上皮オルガノイド移植においても，内視鏡下のGFP蛍光の経時的観察に加え，病理組織学的な1か月以上の生着を確認しえた．

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究では，レシピエントマウスモデルの改変および，培養細胞の最適化によって，ヒト腸管上皮オルガノイドの免疫不全マウスへの同所異種移植の長期生着に成功した．間質との共移植によって移植効率化を図ることを目指してきたが，移植手法の改良により腸管上皮オルガノイド単独での効率的な同所異種移植が達成されたため，当初計画からは一部方向性の転換をはかることとなった．この移植モデル確立の結果，遺伝子改変オルガノイドの移植により，これまでヒトにおいてはモデルが存在しないために成しえなかった，ヒトのLGR5の機能解析を行うステップへすすむことができた．現在投稿準備中であり，研究は順調な進展をみせている．

今後の研究の推進方策

マウスの腸内において，ヒトの幹細胞とマウスの幹細胞における差異を観察し，ニッチ因子との関連につき，検討を加えていく．また，分化細胞マーカーであるKRT20の解析を加えることにより，腸管におけるヒトの細胞の挙動をさらに詳細に解析する．
マイクロミニピッグへの移植に際しては，必要となる細胞の低減および移植効率の向上のため，移植部位に細胞を停留させる移植手法を試みる．また，Xeno-free化のため，移植時に用いる細胞外基質を変更し，さらに条件の最適化を行っていく．

研究成果

• [雑誌論文] Single fecal microbiota transplantation failed to change intestinal microbiota and had limited effectiveness against ulcerative colitis in Japanese patients. (2017)
  • 著者名/発表者名: Shinta Mizuno, Kosaku Nanki, Katsuyoshi Matsuoka, Keiichiro Saigusa, Keiko Ono, Mari Arai, Shinya Sugimoto, Hiroki Kiyohara, Moeko Nakashima, Kozue Takeshita, Makoto Naganuma, Wataru Suda, Masahira Hattori, Takanori Kanai
  • 雑誌名: Intestinal Research 巻: 15 ページ: 68-74
  • DOI: 10.5217/ir.2017.15.1.68
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Endoscopic morphologic features of ulcerative colitis-associated dysplasia classified according to the SCENIC consensus statement. (2017)
  • 著者名/発表者名: Shinya Sugimoto, Makoto Naganuma, Yasushi Iwao, Katsuyoshi Matsuoka, Masayuki Shimoda, Shuji Mikami, Shinta Mizuno, Yoshihiro Nakazato, Kosaku Nanki, Nagamu Inoue, Haruhiko Ogata, Takanori Kanai
  • 雑誌名: Gastrointestinal Endoscopy 巻: 85 ページ: 639-646
  • DOI: 10.1016/j.gie.2016.11.013
  • 査読あり
• [雑誌論文] Ulcerative colitis endoscopic index of severity is associated with long-term prognosis in ulcerative colitis patients treated with infliximab. (2016)
  • 著者名/発表者名: Keiichiro Saigusa, Katsuyoshi Matsuoka, Shinya Sugimoto, Mari Arai, Hiroki Kiyohara, Kozue Takeshita, Shinta Mizuno, Kosaku Nanki, Kiyoto Mori, Yoshihiro Nakazato, Tomoharu Yajima, Makoto Naganuma, Tadakazu Hisamatsu, Haruhiko Ogata, Yasushi Iwao, Takanori Kanai
  • 雑誌名: Digestive Endoscopy 巻: 28 ページ: 665-670
  • DOI: 10.1111/den.12655
  • 査読あり
• [雑誌論文] Ulcerative Colitis Endoscopic Index of Severity is Useful to Predict Medium- to Long-Term Prognosis in Ulcerative Colitis Patients with Clinical Remission. (2016)
  • 著者名/発表者名: Mari Arai, Makoto Naganuma, Shinya Sugimoto, Hiroki Kiyohara, Keiko Ono, Kiyoto Mori, Keiichiro Saigusa, Kosaku Nanki, Makoto Mutaguchi, Shinta Mizuno, Rieko Bessho, Yoshihiro Nakazato, Naoki Hosoe, Katsuyoshi Matsuoka, Nagamu Inoue, Haruhiko Ogata, Yasushi Iwao, Takanori Kanai
  • 雑誌名: Journal of Crohn's and Colitis 巻: 10 ページ: 1303-1309
  • DOI: 10.1093/ecco-jcc/jjw104
  • 査読あり
• [雑誌論文] Indole compounds may be promising medicines for ulcerative colitis. (2016)
  • 著者名/発表者名: Shinya Sugimoto, Makoto Naganuma, Takanori Kanai
  • 雑誌名: Journal of Gastroenterology 巻: 51 ページ: 853-861
  • DOI: 10.1007/s00535-016-1220-2
  • 査読あり
• [雑誌論文] Recent trends and future directions for the medical treatment of ulcerative colitis. (2016)
  • 著者名/発表者名: Makoto Naganuma, Shinta Mizuno, Kosaku Nanki, Shinya Sugimoto, Takanori Kanai
  • 雑誌名: Clinical Journal of Gastroenterology 巻: 9 ページ: 329-336
  • DOI: 10.1007/s12328-016-0686-z
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Stem Cell Research and Treatment: From Bench to Clinical Practice. (2017)
  • 著者名/発表者名: Shinya Sugimoto
  • 学会等名: The 1st Basic Science Research Workshop: Evolving Basic Science in Intestinal Diseases
  • 発表場所: Seoul, Korea
  • 年月日: 2017-02-10 – 2017-02-10
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 腸管上皮オルガノイドを用いた幹細胞移植技術の確立 (2016)
  • 著者名/発表者名: 杉本 真也, 金井 隆典, 佐藤 俊朗
  • 学会等名: 第58回日本消化器病学会大会（JDDW2016）
  • 発表場所: 神戸コンベンションセンター（兵庫県神戸市）
  • 年月日: 2016-11-04 – 2016-11-04
• [学会発表] Cultivation of human norovirus using human duodenal organoids. (2016)
  • 著者名/発表者名: Akira Fujimoto, Kei Haga, Shinya Sugimoto, Toshiro Sato, Yen Hai Doan, Motohiro Miki, Reiko Takai-Todaka, Kazuhiko Katayama
  • 学会等名: The 64th Annual Meeting of the Japanese Society for Virology.
  • 発表場所: Sapporo Convention Center（北海道札幌市）
  • 年月日: 2016-10-24 – 2016-10-24
• [学会発表] Gut environments and human colorectal carcinogenesis. (2016)
  • 著者名/発表者名: Toshiro Sato, Shinya Sugimoto, Mami Matano
  • 学会等名: The 75th Annual Meeting of the Japanese Cancer Association.
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2016-10-08 – 2016-10-08
• [学会発表] Efficacy and safety of fecal microbiota transplantation on ulcerative colitis. (2016)
  • 著者名/発表者名: Shinta Mizuno, Kosaku Nanki, Katsuyoshi Matsuoka, Keiko Ono, Makoto Mutaguchi, Mari Arai, Shinya Sugimoto, Hiroki Kiyohara, Kozue Takeshita, Makoto Naganuma, Takanori Kanai
  • 学会等名: The 4th Annual Meeting of Asian Organization for Crohn's and Colitis (AOCC)
  • 発表場所: Kyoto International Conference Center（京都府左京区）
  • 年月日: 2016-07-07 – 2016-07-07
  • 国際学会
• [学会発表] The Investigation of Medium- to Long-Term Prognosis of Ulcerative Colitis Patients Using Ulcerative Colitis Endoscopic Index of Severity (UCEIS). (2016)
  • 著者名/発表者名: Mari Arai, Makoto Naganuma, Shinya Sugimoto, Hiroki Kiyohara, Keiko Ohno, Kiyoto Mori, Kosaku Nanki, Makoto Mutaguchi, Shinta Mizuno, Rieko Bessho, Yoshihiro Nakazato, Nagamu Inoue, Haruhiko Ogata, Yasushi Iwao, Takanori Kanai
  • 学会等名: Digestive Disease Week (DDW) 2016
  • 発表場所: San Diego, USA
  • 年月日: 2016-05-21 – 2016-05-21
  • 国際学会