細胞周期制御因子とトランスポゾンの組合せによる高品質なブタｉＰＳ細胞の樹立

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15J02085
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 土内 憲一郎 東北大学, 農学研究科, 特別研究員(DC1)
• 研究期間 (年度): 2015-04-24 – 2018-03-31
• キーワード: リプログラミング / トランスポゾン / iPS細胞 / ブタ

研究実績の概要

昨年度より引き続きブタ線維芽細胞不死化株および初代線維芽細胞を用いて、マウス様のiPS細胞を樹立するための実験を行っている。従来より実験に用いていた誘導ベクターにさらに改良を加えたものを作成し導入することで、コロニー出現までの時間は増したもののiPSコロニー自体は再現性良く出現する状況になった。ただしコロニーをpick upしても増殖できないはずれコロニーも多く、安定的に継代できる株を大量に得るまでには課題を残した。
一方、当グループで保有するレンチウイルスベクターを介して樹立したブタiPS細胞を用いて種々の培養条件を検討した。予想と反し、他種において実績のある培養サプリメントを用いた培地に変更しても期待したような改善効果を得ることは出来なかった。
ただ上記の細胞を次世代シークエンサーを用いた発現解析に供した結果、naiveとprimed両方の発現様式をもった中間型の状態にあることがわかった。また、誘導に用いた因子数の違いによる遺伝子発現様式の違いも明らかになった。現在シークエンスリードを増やすことでデータを詳細に再検討しようとしており、よりNaive-likeな細胞を得るための手がかりとしたいと考えている。
最終年度となる3年度目には、遅れているvivoでの多能性評価（テラトーマ形成試験や胚盤胞へのinjection）を行うとともに、トランスポゾンベクターを効率的に除去する方法の開発にも取り組み、当初の目標にある外来遺伝子のないブタiPS細胞の樹立に向けて研究を行う。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

今年度までに安定的に継代できる複数の株を得ている予定であったので、進捗状況の区分は『やや遅れている』とした。最終年度では、上記目標の達成と併行し、当初の目標であったvivoでの多能性評価および外来遺伝子の除去を達成できるよう一層精力的に研究を進めたいと考えている。

今後の研究の推進方策

シークエンスリードを増やし得られた遺伝子発現データを詳細に比較・検討する。現在SRAにはウイルスベクターと山中4因子で樹立されたブタiPSのデータが2種類アップロードされており、それとの比較から必要な遺伝子に関する情報を得る。
また、細胞の培養条件のtuningは引き継ぎ行っていく。具体的には、ヒトやマウスにおいて実績があってまだ試していない培地添加物や、複数の論文にて導入されている低酸素濃度での培養を試す予定である。
最終年度となる3年度目では、テラトーマ形成や胚盤胞への細胞注入などのvivoにおける多能性評価と併行して、トランスポゾンベクターを効率的に除去する手法の開発にも取り組む。最近、組込を行わず除去のみに作用するトランスポゾン転移酵素の報告がなされたため、ベクターないしタンパク質という形での導入を検討していく。