研究課題
葉緑体タンパク質ホメオスタシスと核遺伝子発現が共役していることはよく知られているが、そのシグナル伝達機構は不明である。本研究では、「核由来の葉緑体タンパク質の分解産物(ペプチド)が葉緑体外にシグナルとして排出され、核にある自身の遺伝子発現を抑制する」という仮説を検証する。具体的には1. ペプチドを生成する葉緑体プロテアーゼ-基質の特定、2. 葉緑体から排出されたペプチド断片の検出、3. 包膜局在のペプチドエクスポーターの同定を行う。本年度は、まず1に関しては、葉緑体チラコイド膜上の主要なタンパク質分解酵素であるFtsHの基質の生化学的同定と並行して、後述するペプチドエクスポーター様ABCタンパク質の一つの欠損株と野生株の実生のRNA-seq解析を東京大のグループと共同で行ったところ、葉緑体のもう１つの主要プロテアーゼであるClpの標的と考えられる葉緑体局在の金属貯蔵因子の核遺伝子が変異体で発現上昇していることを見出した。これは、上記ABCトランスポーターの欠損によって、Clp依存的なこの金属関連因子の恒常的分解と同因子の核遺伝子発現の共役関係が脱制御された可能性を示唆している。次に2に関しては、植物体から単離した葉緑体から懸濁液中に排出されるタンパク質分解産物の回収と検出には相当量の葉緑体が必要と考えられたため、安定かつ高収率で無傷葉緑体を単離する植物生育条件(光強度、日長、糖濃度等)と葉緑体単離法を最適化した。一方3については、3種のエクスポーター様タンパク質と1種の協調制御因子の欠損株と特異抗体を作成した。特に抗体を用いた生化学的解析から、上記3種はいずれも葉緑体包膜に局在し、かつ各々異なる光誘導型発現パターンを示す独立な複合体(二量体2種、四量体1種)として存在することが分かった。さらにこれらのペプチド輸送活性については学内の別グループとの共同研究が進行中である。
2: おおむね順調に進展している
1に関しては、通常条件下で生育した野生株及びFtsHの点変異体と欠損株各々から単離したチラコイド膜と抗FtsH2サブユニット抗体を用いた免疫共沈降実験(Co-IP)を計画通り行い、点変異体でのみトラップされて濃縮・検出されるタンパク質(＝基質候補)の回収を試みた。その結果、FtsH2と他のFtsHサブユニットが共沈したことからCo-IP自体は成功しているものの、FtsHのモデル基質と既知の基質候補は架橋剤による安定化処理の有無に依らず回収されないことが分かった。一方、上述したRNA-seq解析を行ったところ、ハウスキーピングプロテアーゼであるClpによる金属関連因子の核遺伝子発現制御にABCトランスポーターの一つが関与している可能性が出てきた。これに関しては、葉緑体タンパク質分解に駆動される核遺伝子発現制御と特定のトランスポーター機能を関連付けるという、基質同定の次のステップに達しつつあると期待できる。また2についても、排出されるペプチドの検出実験の第一段階である安定な無傷葉緑体の効率的な単離法を確立できた。さらに3に関しては、当初は抗体作成のみを予定していたが、4種のABCタンパク質の組換体タンパク質(抗原)の発現・精製と特異抗体の作成が順調に進んだこともあり、2年目の予定としていた、3種のエクスポーター様タンパク質の生化学的特徴付けを先行して行うことができた。特に葉緑体包膜への局在性はエクスポーターである大前提であり、かつ3者がそれぞれ独立の複合体を形成するという特性は各々の関係性を知る上で不可欠である。またこれら得られた結果は、植物葉緑体の未知のABCトランスポーターの知見としても新規性は高い。加えて、上記4種のABCタンパク質の欠損変異体の確立も、2年目に予定していたが初年度中に達成できた。以上を総合的に判断して自己評価とした。
1については、上記Clpと金属関連因子の関係性を軸にABCトランスポーターの核遺伝子制御への関与を検証するとともに、FtsHの基質単離も並行して行う。FtsH基質単離に関しては、FtsHによるモデル基質の分解が光強度に依存することと、初年度使用したチラコイド膜が通常条件下で生育した植物体から調製したことを考慮して、2年目は強光ストレス処理した植物体から調製したものを用いてCo-IPを行う。またチラコイド膜調製前の無傷葉緑体に対して架橋剤処理を行うことで、その後の葉緑体分画中の基質-酵素複合体の安定化を狙う。2に関しては、初年度に確立した方法により野生株とトランスポーター変異体から葉緑体を多量に調製し、ペプチド放出の有無をHPLCにより検証する。3については、3種のトランスポーターの包膜上でのトポロジーを生化学的に決定すると共に、共同研究によりペプチド輸送活性の有無を確認する。さらに初年度のRNA-seq解析から、活性酸素種の発生に応答する転写因子群及びシグナル伝達因子の遺伝子発現がABCタンパク質欠損株では亢進していることが見いだされており、それらの関係についても解析する。
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Plant Physiology
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https://scholar.google.co.jp/citations?user=ZA8THGMAAAAJ
