| 研究課題/領域番号 |
15J03774
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
上松 篤史 愛媛大学, 理工学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-24 – 2018-03-31
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| キーワード | ポリユビキチン鎖 / シグナル伝達 / プロテインアレイ / ユビキチン結合タンパク質 / 20K-HUPA |
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| 研究実績の概要 |
今年度は、シグナル伝達関連アダプタータンパク質のプロテインアレイ作製及び本研究室で構築済みの直鎖状ポリユビキチン鎖を用いて20,000種類からなるプロテインアレイ(20K-HUPA)によりポリユビキチン鎖と相互作用するシグナル伝達関連タンパク質を網羅的に探索し、直鎖状ポリユビキチン鎖特異的に結合する新規なユビキチン結合タンパク質(UBP)を10種類同定した。
主な研究実績は以下の通りである。
【シグナル伝達関連アダプタータンパク質のプロテインアレイの作製】本研究室で保持する2万種類近くのヒト完全長cDNAリソース中に含まれる計50種類のシグナル伝達関連アダプター遺伝子をクローニングした。また、これらの鋳型を用いてコムギ無細胞合成系により転写・翻訳を行い、50種類のシグナル伝達関連アダプタータンパク質のプロテインアレイを作製した。加えて、産業技術総合研究所及びセルフリーサイエンス社(株)との共同研究により、20K-HUPAを用いて網羅的探索を行った。
【直鎖状ポリユビキチン鎖相互作用タンパク質の網羅的探索】直鎖状ポリユビキチン鎖と相互作用するUBPの網羅的探索を20K-HUPAを用いてAlphaScreenにより行った。その結果、少なくとも相互作用が報告されている13種類のUBP及び新規のUBP32種類を同定した。
【直鎖状ポリユビキチン鎖特異的に相互作用するタンパク質の同定】直鎖状ポリユビキチン鎖と相互作用するタンパク質の網羅的探索でヒットしたUBPが他のポリユビキチン鎖やモノユビキチンにも結合する可能性があるため、ヒットタンパク質のポリユビキチン鎖への特異性をAlphaScreenにより調べた。その結果、10種類の直鎖状ポリユビキチン鎖特異的に相互作用するUBPを同定することに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は【シグナル伝達関連アダプタータンパク質のプロテインアレイの作製】及び【K63型及び直鎖状ポリユビキチン鎖相互作用タンパク質の網羅的探索】を研究計画にしていたが、プロテインアレイの作製並びに直鎖状ポリユビキチン鎖相互作用タンパク質の網羅的探索のみならず、直鎖状ポリユビキチン鎖特異的に結合するタンパク質の同定に成功した。
主な進捗状況は以下の通りである。
シグナル伝達関連タンパク質のプロテインアレイの作製及びポリユビキチン鎖と結合するタンパク質の網羅的探索を本年度の計画予定にしていたが、計画通り、50種類のシグナル伝達関連タンパク質のプロテインアレイ作製に成功した。また、産業技術総合研究所及びセルフリーサイエンス(株)との共同研究により予定していた約800種類を大きく上回る20,000種類のタンパク質(20K-HUPA)を用いての探索を行えるようになった。
予備実験的に行ったK63型ポリユビキチン鎖と結合が既知のタンパク質TAB2を用いたが、市販のK63型のポリユビキチン鎖がワークしなかったために、アッセイを行うことができなかった。また、直鎖状ポリユビキチン鎖と結合するタンパク質の探索に関しては、予備実験的に行った直鎖状ポリユビキチン鎖と結合が既知のタンパク質A20を用いた結合実験が成功したため、20K-HUPAを用いてAlphaScreenにより探索を行ったところ、少なくとも相互作用が報告されている13種類のUBP及び新規のUBP32種類を同定した。また、直鎖状ポリユビキチン鎖の特異性を確認したところ、新規に10種類の直鎖状ポリユビキチン鎖特異的に結合するタンパク質を同定した。これらのことから、K63型ポリユビキチン鎖の網羅的な探索は行えなかったが、直鎖状ポリユビキチン鎖の探索においては探索のみならず、特異性まで同定できたため、おおむね順調に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
直鎖状ポリユビキチン鎖特異的に結合する新規のタンパク質はCUEやUBDのユビキチン結合ドメインを含んでおり、直鎖状ポリユビキチン鎖形成によりリクルートされ、シグナル伝達を制御している可能性が考えられる。そこで現在、同定タンパク質の培養細胞内でのポリユビキチン鎖との結合を評価するため、細胞発現用ベクターに組み込んでいる。また、同定タンパク質を精製し、Biacoreを用いて直鎖状ポリユビキチン鎖に対するAffinityを算出予定である。さらに、今回実施できなかったK63型ポリユビキチン鎖との結合実験を再度行い、20K-HUPAを用いた網羅的な探索を行う予定である。
主な今度の方策は以下の通りである。
【細胞内での相互作用タンパク質因子とポリユビキチン鎖との結合評価】アラニン置換法や欠損変異体を作成し、相互作用が確認された新規分子のポリユビキチン鎖との結合領域を培養細 胞を用いてポリユビキチン鎖特異的抗体で免疫沈降することにより調べる。
【ポリユビキチン鎖依存的キナーゼ活性化及びE3リガーゼ活性化の生化学的解析】ポリユビキチン鎖添加によるキナーゼ活性やユビキチン化活性への影響を既知の基質を用いて生化学的に解析する。キナーゼ基質タンパク質のリン酸化が亢進されるか、抑制されるか、あるいは変化 がないかまたは既知の基質タンパク質のユビキチン化が亢進されるか、抑制されるか、あるいは変化がないかをAlphaScreenにより確認する。また、Biacoreを用いてポリユビキチン鎖に対するAffinityを算出予定である。
【K63型ポリユビキチン鎖結合タンパク質の網羅的探索】市販のK63型のポリユビキチン鎖を再度購入し、TAB2との結合実験が成功した後、20K-HUPAを用いた網羅的探索を行う。
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