| 研究課題/領域番号 |
15J04343
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
堀田 彰一朗 京都大学, 医学研究科, 特別研究員(PD)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-24 – 2018-03-31
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| キーワード | X線結晶構造解析 / GPCR |
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| 研究実績の概要 |
研究代表者は、体内において恒常性維持への関与の可能性が示唆されているヒトGPCRを標的とし、高分解能での構造決定を目指している。また、膜タンパク質の高分解能構造を決定する上で必要な基盤技術開発を目指している。本研究課題における昨年度の研究実績の概要は下記の通りである。
初年度は、標的GPCRの物性評価（蛍光ゲル濾過クロマトグラフィー法と熱安定性評価を組み合わせた物性評価法）の結果から大量発現及び結晶化に適したコンストラクトの設計を行った。マウスから単離した標的GPCRのFab化抗体を併用することで、ゲル濾過クロマトグラフィーにおいて単分散性が良好な標的GPCR-Fab化抗体複合体の精製法を確立した。次に、脂質メソフェーズ結晶化法を用いて結晶作製を試みた結果、主にsponge phase中に良質な板状の結晶を得ることに成功した。得られた結晶を液体窒素中に凍結の後、大型放射光施設SPring-8のマイクロフォーカスビームラインBL32XUにおいて、得られた結晶のスクリーニング及びデータセットの収集を行った。また、データセットを可能な限り多く集め構造決定に用いる最終的な回折データセットとした。回折データセット取得の後、Fab化抗体と融合タンパク質、既に登録されている活性型・非活性型GPCRの構造を鋳型として分子置換法を用いることで初期位相を決定、その後の精密化を通して位相改良とモデルの構築を行い、最終的に3.2オングストロームにおける立体構造の決定に成功し、細胞外領域における構造基盤を明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現在までの進捗状況は下記の通りである。
研究計画調書に従い、標的GPCR及びマウスの腹水から単離取得したFab化抗体をそれぞれ精製した。複合体サンプルを調製の後ゲル濾過クロマトグラフィーによって結合能を確認、精製を行った。次に、精製サンプルの濃縮を行い、脂質と混合後サンプル試料を含んだLCPを作製した。結晶化には結晶化ロボットを用い、サンドウィッチプレート上に50nLずつサンプルを打ち込みドロップを作製した。その結果、高殻側に回折斑点を与える高品質結晶を得ることに成功した。得られた結晶を凍結の後、大型放射光施設SPring-8のBL32XUマイクロフォーカスビームラインにおいてデータ収集を行った。可能な限り多く集めたデータセットをマージすることで、最終的に3.2オングストロームでのデータセットの収集に成功し、これを構造決定に用いる回折データセットとした。
Fab化抗体及び融合タンパク質、また活性型・不活性型を含む典型的な７回膜貫通型のGPCRの構造を鋳型とし分子置換法による位相決定を試みた結果、初期位相の決定に成功した。初期位相決定の後、モデルの精密化作業を繰り返すことにより、位相の改良を行い、最終的に最高分解能3.2オングストロームでの構造決定に成功した。また得られた構造情報を基にbinding assay等の変異体解析を行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究の推進方策は下記の通りである。
変異体実験を引き続き行うと同時に、決定した構造に関する論文の執筆を行う。完成し次第、雑誌に投稿予定である。また、さらなる高分解能構造決定のため、融合タンパク質の種類を変える等、コンストラクトを組み替え結晶のパッキングを改善することで、さらなる高品質結晶を作製し同様の手法で結晶化を試みる。
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