立体構造を基盤に内在性リガンドの探索を目指したヒト由来機能未知ＧＰＣＲの構造解析

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15J04343
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 堀田 彰一朗 京都大学, 医学研究科, 特別研究員(PD)
• 研究期間 (年度): 2015-04-24 – 2018-03-31
• キーワード: X線結晶構造解析

研究実績の概要

標的GPCRの物性評価法の確立
蛍光ゲル濾過クロマトグラフィー法と熱安定性評価を組み合わせた物性評価法の確立により、ゲル濾過クロマトグラフィーにおいて熱安定性が高く単分散性が良好な標的GPCRのコンストラクトを選別することに成功した。
フィルムサンドウィッチ法の開発
ガラスサンドウィッチ法を用いた脂質メソフェーズ結晶化法においては、得られた結晶がスポンジ相の中に得られた場合、結晶を拾うのに困難が伴う。特に細胞外領域や細胞内領域のドメインが大きい場合またはFab抗体との複合体状態で構造解析を目指す場合、得られる結晶はスポンジ相になりやすい。フィルムサンドウィッチ内に結晶を作製することによりそのままX線を照射できるため結晶を無駄にしなくて済む。フィルムサンドウィッチ内部に作製される結晶の品質を調べた結果、フィルムサンドウィッチ法においてもガラスサンドウィッチ法と同程度の分解能を与える結晶を得ることに成功した。
標的GPCRの構造決定
データセットを可能な限り多く集め構造決定に用いる最終的な回折データセットとした。回折データセット取得の後、Fab化抗体と融合タンパク質、既に登録されている活性型・非活性型GPCRの構造を鋳型として分子置換法を用いることで初期位相の決定を試みた。次に、その後の精密化を通して位相改良とモデルの構築を行い、最終的に3.2オングストロームにおける立体構造の決定に成功し、細胞外領域における構造基盤を明らかにした。

現在までの達成度 (段落)

29年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

29年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Crystal structure of the human Angiotensin II type-2 receptor bound to an Angiotensin II analog (2018)
  • 著者名/発表者名: Asada H, Horita S, Hirata K, Shiroishi M, Shiimura Y, Iwanari H, Hamakubo T, Shimamura T, Nomura N, Kusano-Arai O, Uemura T, Suno C, Kobayashi T, Iwata S
  • 雑誌名: Nature Structural & Molecular Biology 巻: N.D. ページ: N.D.
  • DOI: N.D.
  • 査読あり