| 研究課題/領域番号 |
15J04640
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
新井 瑶子 京都大学, iPS細胞研究所, 特別研究員(PD)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-24 – 2018-03-31
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| キーワード | 一過性骨髄増殖症 / 多段階発癌 / 血球分化 / 活性酸素種 |
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| 研究実績の概要 |
血球分化において重要な活性酸素種を同定し、ダウン症に合併する前白血病(TAM)及び白血病の多段階発癌機序の解明を、 1) trisomy 21によるゲノム不安定性、 2) GATA1変異の影響及び、3) エピゲノムの変化という視点から検討することを目標に研究を行っている。
実験には、 Informed consentを文書にて得た、TAMを発症していないダウン症患者及び、TAMを発症したダ ウン症患者由来のiPS細胞を樹立し、ゲノム編集技術を用いてGATA1遺伝子変異を導入、あるいは修復し、isogenicなiPS細胞を作製し、実験を行う。
まずは、作製したTAM患者由来のiPS細胞を血球分化させる過程でエピゲノムの変化、さらにはGATA1遺伝子変異の影響を検討する。また血球分化において、どの種の活性酸素種が、どの段階で影響を及ぼしているかを同定することで、血球分化における活性酸素種の役割を解明し、同定した活性酸素種を調節することにより、TAMでない患者由来のiPS細胞からの血球分化過程でGATA1変異やエピゲノム変化が誘導されるかどうかを検討する。
さらに、マウスを用いた系において、GATA1変異を獲得した血液前駆細胞を移植し、活性酸素種を調節することで、病態再現 ・発症機序の解明を試みる。
本研究により小児白血病発症のメカニズムの一端が明らかとなり、生体モデルを含めた新たな疾患解析モデルが確立されれば、将来これらを用いたさらなる解析や、治療へと結びつく研究や新薬の開発へとつながり、真の白血病克服への可能性が開かれる。また、活性酸素種の血球分化や多段階発癌機構への関与が明らかになることで、白血病だけでなく他臓器における癌の制御にも繋がる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度は疾患特異的iPS細胞の樹立、ゲノム編集と血球分化解析を行った。TAM患者1名の芽球及び寛解時の末梢血単核球より樹立したiPS細胞、及びTAMを発症していないがトリソミーとダイソミー双方を含むダウン症患者由来B細胞株より樹立したisogenicなトリソミー/ダイソミーiPS細胞を得た。iPS細胞の樹立はエピソーマルベクター6因子を用いて行い、TAM芽球由来iPS細胞で患者細胞と同様のGATA1変異を有することを確認した。さらに、TAM患者の芽球由来iPS細胞において、TALENを用いてGATA1変異の修復を行ったクローンを得た。また、TAMではないダウン症患者由来のトリソミー/ダイソミーiPS細胞パネルについて、CNV解析を行い、適正クローンの選別を実施、クローンを選択後、TALENを用いてGATA1変異を導入したクローンを得た。
次に、単層培養でstep-wiseに血球分化を行う方法を用いて、分化実験を行った。まず多能性の血球前駆細胞（CD34+CD43+）への分化能を検討したところ、21番染色体とGATA1のステータスによる優位な差は検出されなかった。さらに各血球系譜へ分化を進めると、21番染色体の数には関わらず、GATA1変異を有する株で、CD71+CD235a+赤芽球系細胞への著しい分化阻害、CD41+CD42b+巨核芽球系細胞への成熟阻害が認められた。一方、CD41-CD43+骨髄球系細胞細胞への分化については、分化効率の増大が認められた。また、赤芽球系への分化阻害が著しかったことから、この表現型を用いて薬剤スクリーニングを行うための血球分化系の最適化を試みた。
最後に健常人末梢血由来の好中球を用いて活性酸素種を検出する系を応用し、iPS細胞において蛍光プローブを用いてフローサイトメトリーでの活性酸素種の検出系の構築を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
来年度以降は、TAM患者及びTAMではないダウン症患者由来のiPS細胞において、血球分化した際に見られる前駆細胞を細分化し、より表現型に差の出る分画を見出し、21番トリソミー及びGATA1変異が血球分化に及ぼす影響の詳細について検討する予定である。見出した分画の前駆細胞を抽出し、エピゲノム解析も行う予定である。それにより、GATA1タンパク及びGATA1変異タンパクの機能の探索を試みる。
また、血球分化の過程において各分化ステージ毎に、SOD、RUNX1、MPO等の活性酸素種関連遺伝子及びタンパクの発現量を測定することで、血球分化の過程において、trisomy21の影響を最も受ける活性酸素種を同定する。直接的に活性酸素種を測定することが困難でも、mRNAやタンパク質レベルでの発現変化を見ることで現象を捉えることが出来ると考えている。さらに、活性酸素種を直接測定する系の構築を試みると同時に、現在行っている薬剤スクリーニング用に最適化した血球分化系を用いて、血球分化過程で活性酸素種の種別の阻害剤や生成剤を投与することにより、血球分化の表現型が変化するかどうかを調べることで、間接的に血球分化への活性酸素種の関与を探索する予定である。
さらに、先に同定した患者由来iPS細胞を用いた血球分化において最も重要な活性酸素種を調節することにより、GATA1タンパクの作用やエピゲノムの変化が誘導されるかどうかも検討し、最終的にはin vivoの系でも検討を行い多段階発癌の機序解明に迫りたいと考えている。
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