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2015 年度 実績報告書

オプトジェネティクスを用いたMuse細胞の分化メカニズムの解明

研究課題

研究課題/領域番号 15J05551
研究機関東北大学

研究代表者

五十嵐 敬幸  東北大学, 医学系研究科, 特別研究員(DC1)

研究期間 (年度) 2015-04-24 – 2018-03-31
キーワードオプトジェネティクス / カルシウムシグナル / オルガネラ
研究実績の概要

本研究では高い時空間分解能での細胞内カルシウムシグナルの制御により、活動依存的な多能性幹細胞の分化メカニズムの解明を目指す。その実現に向けて、細胞内カルシウムストアとして機能する小胞体局在型オプトジェネティクスツールの開発とその機能解析を行った。
細胞内からのCa2+放出を選択的に制御するために、細胞内Ca2+ストアである小胞体に特異的に局在する光応答性のカチオンチャネル(ChRER)を開発した。緑藻類由来の光感受性カチオンチャネルであるチャネルロドプシン(ChR)改変体に小胞体係留シグナルを付加し、イオン選択性、光応答特性を最適化した複数種類のプラスミドの作製に成功した。
①局在解析:複数の細胞種へChRER(改変体3種類)を遺伝子導入し、発現を確認した。組織学的局在解析では、小胞体マーカーであるKDEL,ER-trackerとの共局在を示し、細胞膜マーカーWGAとは共局在しないということが超解像顕微鏡下で確認された。
②Ca2+イメージング:ChRERが光に同期して開口しているかを確かめるために、タンパク質性赤色蛍光カルシウムセンサーR-CaMP1.07を用いた生理学実験を行った。R-CaMP1.07陽性の細胞集団において、青色LED光刺激に同期して赤色蛍光が増加した。この光刺激応答性の赤色蛍光増強は、細胞外Ca2+非存在下でも消失しなかったことから、細胞内Ca2+ストアからのCa2+放出が光刺激によって誘起されていることが示唆される。
③膜電位変化解析:細胞膜上のChRER発現の有無を確かめるため、パッチクランプ法により光刺激前後の細胞膜電位の変化を計測した。ChRER発現細胞では光電流は観察されなかったことから、細胞膜上にChRERが発現していないことが示された。
以上の結果より、ChRERの利用により、細胞内からのCa2+放出を選択的に、光で制御できることが示唆された。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

本年度においては小胞体局在型オプトジェネティクスツールの開発に成功し、組織学的局在解析・パッチクランプ法を用いた電気生理学的実験・カルシウムイメージングによる生理学的機能の評価を行った(研究室の代表的な研究成果として、生理研研究会において口頭発表)。また、オプトジェネティクスやコネクトミクスなど、最先端の神経科学研究に資する新規トランスジェニックラット 4系統(寄託手続き中の系統を含む)を作製し、ナショナルバイオリソースプロジェクト「ラット」( http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/nbr/Default_jp.aspx )を通じて世界中の研究者に提供している。これらの研究成果は、査読のあるオープンアクセス国際誌に1報報告しているとともに、First & corresponding author論文を1報投稿中である。国際学会で3件、国内学会で5件(うち口頭発表2件)において発表していることから、進展が順調であると評価した。

今後の研究の推進方策

これまで得られた結果より、ChRERの利用により、細胞内からのCa2+放出を選択的に、光で制御できることが示唆された。今後はこのツールを用いて多能性細胞の分化メカニズム及び筋や神経細胞の機能獲得プロセスに関する新規知見を得る。現在は筋芽細胞株を用いて、収縮機能の獲得において必須とされる最小構成単位(サルコメア)の形成が細胞内Ca2+放出に付随して促進されるという仮説の検証を進めている。

  • 研究成果

    (8件)

すべて 2016 2015

すべて 雑誌論文 (1件) (うち国際共著 1件、 査読あり 1件、 オープンアクセス 1件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (7件) (うち国際学会 2件)

  • [雑誌論文] A Phox2b BAC Transgenic Rat Line Useful for Understanding Respiratory Rhythm Generator Neural Circuitry.2015

    • 著者名/発表者名
      Ikeda K., , Takahashi M., Sato S., Igarashi H., Ishizuka T., Yawo H., Arata S., Southard-Smith EM., Kawakami K. Onimaru H.
    • 雑誌名

      PloS One

      巻: 10(7) ページ: e0132475.

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0132475.

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
  • [学会発表] Development of new optogenetic tools to manipulate internal Ca2+ dynamics2016

    • 著者名/発表者名
      五十嵐 敬幸
    • 学会等名
      第8回 大学院生研究発表会 「次世代を担う若手研究者の挑戦~医学研究の最前線~」
    • 発表場所
      東北大学医学部6号館, 宮城県仙台市
    • 年月日
      2016-01-17
  • [学会発表] 新規トランスジェニックラット3系統の開発 -tdTomatoレポーターラット, Flameラット, ChR(SFO)発現ラット-2015

    • 著者名/発表者名
      五十嵐 敬幸
    • 学会等名
      2015年度 包括脳ネットワーク冬のシンポジウム
    • 発表場所
      一橋大学 一橋講堂 学術総合センター 2F, 東京
    • 年月日
      2015-12-17 – 2015-12-19
  • [学会発表] 小胞体局在型新規オプトジェネティクスツールの開発2015

    • 著者名/発表者名
      五十嵐 敬幸
    • 学会等名
      生理学研究所 研究会 「シナプス・神経ネットワークの機能ダイナミクス」
    • 発表場所
      生理学研究所, 愛知県岡崎市
    • 年月日
      2015-12-02 – 2015-12-03
  • [学会発表] 新規トランスジェニックレポーターラットの開発 -赤色蛍光タンパク質(tdTomato)及びステップ関数型オプシンレポーターラットの解析-2015

    • 著者名/発表者名
      五十嵐 敬幸
    • 学会等名
      生理学研究所 研究会 「シナプス・神経ネットワークの機能ダイナミクス」
    • 発表場所
      生理学研究所, 愛知県岡崎市
    • 年月日
      2015-12-02 – 2015-12-03
  • [学会発表] Novel transgenic animals for tracing and optogenetics -Flame rats and bistable ChR reporter rats-2015

    • 著者名/発表者名
      五十嵐 敬幸
    • 学会等名
      NTNU - Tohoku Univ. Brain Science Meeting
    • 発表場所
      東北大学 生命科学プロジェクト総合研究棟, 宮城県仙台市
    • 年月日
      2015-11-25 – 2015-11-27
    • 国際学会
  • [学会発表] Development of a novel transgenic rat strains -Flame rats and ChR reporter rats-2015

    • 著者名/発表者名
      Hiroyuki Igarashi
    • 学会等名
      Society for Neuroscience 45th annual meeting
    • 発表場所
      McCormick Place, Chicago, Illinois, USA
    • 年月日
      2015-10-17 – 2015-10-21
    • 国際学会
  • [学会発表] 新規トランスジェニックレポーターラットの開発 -赤色蛍光タンパク質(tdTomato)及びステップ関数型オプシンレポーターラットの解析-2015

    • 著者名/発表者名
      五十嵐 敬幸
    • 学会等名
      第1回「適応回路シフト」領域会議
    • 発表場所
      ホテルグランデコ, 福島県耶麻郡北塩原村
    • 年月日
      2015-06-25 – 2015-06-26

URL: 

公開日: 2016-12-27  

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