研究課題
本研究では、細胞内セカンドメッセンジャーとして機能するカルシウムイオン(Ca2+)を光操作し、活動依存的な多能性幹細胞の分化メカニズム解明を目指した実験を行った。その過程において、高い時空間分解能での細胞内Ca2+ダイナミクス制御を実現するために、細胞内Ca2+ストアとして機能する小胞体に特異的に局在する光遺伝学ツールの開発に成功した。この新規光遺伝学ツールを単能性を有する筋芽細胞株(C2C12)に発現させたところ、(1) 超解像顕微鏡下で小胞体マーカー(KDEL)との共局在が確認でき、細胞膜マーカー(WGA)の発現パターンとは一致しなかった。(2) 蛍光カルシウムインジケーターRhod-FFによってリアルタイムカルシウムイメージングを行ったところ、青色光刺激と同期した赤色蛍光の上昇が確認され、この上昇は細胞外Ca2+非依存的に持続した。しかし、Calcium transport ATPase (SERCA)阻害薬のThapsigargin存在下で頻回光刺激を与えるとこの応答は消失した。(3) パッチクランプ法により、細胞膜発現型チャネルロドプシン(ChR)と小胞体局在型ChR発現細胞の光電流を比較したところ、膜発現型ChRが光刺激と同期して大きな光電流を誘起したのに対し、小胞体ChRでは光電流が流れなかった。上記結果をまとめ、論文として投稿した。また、筋細胞分化における小胞体Ca2+放出の影響を調べた論文を現在準備中である。並行して、光遺伝学研究を推進するために、ステップ関数型オプシンをCre存在下においてユビキタスに発現する遺伝子改変ラットの作製に成功し、解析結果をまとめて論文として発表した(Igarsahi et al., 2018)。
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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Scientific Reports
巻: 8 ページ: -
10.1038/s41598-018-23810-8
