| 研究課題/領域番号 |
15J05983
|
|---|
| 研究機関 | 広島大学 |
|---|
研究代表者 |
高山 和也 広島大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2015-04-24 – 2018-03-31
|
| キーワード | dnmt3aa / zebrafish / regenertaion / mTORC1 / リソソーム |
|---|
| 研究実績の概要 |
昨年度にCRISPR/Cas9システムによって樹立したdnmt3aa変異体の解析を行った結果、2系統樹立したdnmt3aa変異体は発生過程および再生過程に異常を示さないことが明らかとなった。再生過程において複数回切断した後の再生尾ビレでは野生型においてもDNAのメチル化が顕著に減少することが明らかとなっている。このことから、dnmt3aa変異体に同処理を行うことにより、再生過程においてさらなるDNAメチル化の減少を誘導することができると考え、同様の実験を行い再生過程の観察・解析を行うことにした。その結果、dnmt3aa変異体において複数回切断すると、徐々に再生によって復元する尾ビレが有意に伸長することを明らかにした。
さらに、私は位置特異的な尾ビレ再生を誘導するメカニズムとして、昨年度報告したmTORC1経路の活性メカニズムに焦点を当て、解析を行った。その結果、切断直後より切断面付近に局所的に活性化が見られるリソソームを介したmTORC1経路の活性が位置特異的な再生を制御していることを示唆する結果を得ることができた。近年、リソソームの活性化によって活性化が誘導されるmTORC1経路は細胞内に取り込まれたアミノ酸センサーとして働き、細胞内の代謝や細胞成長などに機能することが報告されている。このことより、特定のアミノ酸で処理した個体における、mTORC1経路の活性を調べたところ、顕著に上昇することが明らかとなった。これらの結果より、尾ビレ再生時に確認できた位置特異的なmTORC1経路の活性化の差は、切断直後に生じるアミノ酸の積極的な取り込みにより、リソソームの活性化が生じることで誘導されていることが明らかとなった。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
昨年度に作製したdnmt3aaの変異体を用いた解析が順調に進んでいる。dnmt3aa変異体において、初回の切断実験において通常の再生を示す個体が、複数回の切断実験を経験した個体では、dnmt3aa変異体特異的に再生尾びれが伸長するといった表現型を示すことを明らかにした。これは、dnmt3aaの発現パターン解析で再生特異的に遺伝子発現が上昇すること、複数回の再生実験においてDNAメチル化度はゲノムワイドに減少することから、予想通り再生異常を示すことを明らかにした。さらに、DNAのメチル化の減少は再生を活性化していることが予想できる表現型であったことから、再生の誘導および活性化メカニズムに重要な機能を有していることが予想でき、以降詳細に機能解析を行うことを予定している。
また、位置特異的再生過程位の解析として、新たにmTORC1経路の機能を明らかにすることができており、これまで報告のないアミノ酸による活性化経路に焦点を当てた解析での結果を得ることができている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
樹立したdnmt3aa変異体における、複数回切断実験での再生過程の解析を行う。野生型と変異体において切断未経験および切断3回経験した個体での再生の比較を遺伝子発現レベルで解析を行い、さらに、発現解析を行った遺伝子の中で、顕著に発現が変化していたものに対して、バイサルファイトシーケンスを行い、遺伝子発現に影響を与えうる領域のDNAメチル化の解析を行うことを予定している。dnmt3aaの遺伝子発現は発生過程で顕著に上昇することが分かっており、特に腎臓および肝臓での発現が器官特異的に上昇することを報告している。これら器官の形成異常は、再生に関与する様々な生理活性を有するホルモンや酵素の分泌に関わることが予想される。このことより、ゼブラフィッシュの生体における各組織・器官の評価を行うために、各マーカー遺伝子の発現を器官別に調製したcDNAライブラリーを用いて、遺伝子発現解析を行う。さらに、各器官の切片を作製し、解剖学的な評価も同時に行うことで、dnmt3aa変異体の詳細な解析を行うことを予定している。
mTORC1に焦点を当てた位置特異的な再生過程の解析として、切断直後より上昇が確認できる活性化リソソームの解析は、その誘導メカニズムをアミノ酸輸送体に焦点を当て解析を行うことを予定している。特にL型アミノ酸輸送体は、今回処理実験を行った特定のアミノ酸の輸送に大きく影響を与えていることが予想できることより、阻害剤実験を実施し、その影響を確認することを計画している。これより、切断直後に生じる位置特異的なmTORC1経路の活性化の誘導メカニズムの詳細を明らかにすることができると考えており、これまで得た実験データをまとめ、今年度中に論文発表することを予定している。
|
