研究課題
本研究課題は、脊椎動物における終脳発生の進化的多様性の理解とその起源の解明を目的としている。これまで終脳発生に従った進化的多様性の変化は形態的違いについての言及が主で、定量的な指標を用いた多様性の評価は殆ど行われてこなかった。本研究課題では、進化的多様性の定量的評価として、相同遺伝子セットの遺伝子発現プロファイルの類似度を採用し、課題に取り組んでいる。今年度では、脊椎動物5種の発生段階ごとの終脳の遺伝子発現プロファイルの決定に必要な手法の確立と、遺伝子発現プロファイルの解析パイプラインの開発を行った。本研究では、早い発生段階における終脳も対象としているため、非常に少ない細胞数から遺伝子発現プロファイルを決定する必要がある。微量のtotal RNAからRNAシークエンシングを行うため、一細胞からでもtotal RNAを増幅することができるQuartz-seqを導入した。この方法を用いて数百ピコグラムのtotal RNAから高い再現性で遺伝子発現プロファイルを決定することができた。これにより、早い発生段階における小さな終脳からでも遺伝子発現プロファイルを決定することができ、発生段階を通した進化的多様性の変遷を追うことができる。遺伝子発現プロファイルを生物種間で比較するための解析パイプラインの開発も進めた。また、生物種間で遺伝子発現を比較するために相同遺伝子を決定する必要があるため、公共のゲノムデータと遺伝子アノテーションデータに基づいた脊椎動物5種の相同遺伝子セットを準備した。テスト用のRNAシークエンシングデータを用いて、この解析パイプラインが問題なく動くことも確認しており、遺伝子発現プロファイル決定後すぐに生物種間比較を行うことができる状態にある。
3: やや遅れている
今年度は、対象とした脊椎動物種から終脳組織をサンプリングするための技術習得と並行して、RNAシークエンシングの手法の導入を行った。発生の早い段階における終脳からは、採取できるtotal RNA量が微量であるため、通常のライブラリ調整方法ではRNAシークエンシングを行うことができない。よって、遺伝子発現プロファイルを決定に進む前に、微量のtotal RNAからRNAシークエンシングを行う手法を導入することが必要だった。発生初期と比較して、発生後期の終脳組織は多数の細胞から成り、通常のライブラリ調整を行うために充分なtotal RNAを採取できる。しかし、サンプル間で異なる方法を採用するとサンプルの違いと手法の違いを区別できなくなるため、全てのサンプルに対して同じ手法を採る必要がある。そこで、今年度は発生後期の終脳サンプルのRNAシークエンシングを行うより、実験手法の確立を優先させた。現在、微量のtotal RNAから遺伝子発現プロファイルを再現性良く決定することができるようになっている。また、情報解析を行うための環境の構築は既に完了しており、パイプラインの開発についても問題なく進展している。相同遺伝子セットの準備は完了し、また遺伝子発現プロファイルの決定と生物種間比較のためのパイプラインも準備できている。加えて、各サンプルのRNAシークエンシングデータのクオリティチェックやリファレンスゲノムへのマッピングについても同様に実行可能な状況にある。
脊椎動物5種の発生段階ごとの終脳サンプルからRNAシークエンシングを行っていく。シークエンシングを行ったサンプルからクオリティチェック、ゲノムへのマッピング、遺伝子発現プロファイルの決定を順次行う予定である。決定した遺伝子発現プロファイルの生物種間比較から、発生に伴う進化的多様性の変遷を追っていく。パイプラインの開発についても、研究計画通り進めていく予定である。本研究の特色の一つに、終脳発生における進化的多様性をゲノムレベルの変化から形態レベルの変化まで繋げて理解する、という点が挙げられる。しかし、各発生段階において機能的なゲノム領域がわかっていない場合、生物種間比較から予測されるゲノムの変化と遺伝子発現プロファイルの変化を結びつけることは極めて難しい。そのため、各発生段階において機能的であるゲノム領域を同定することが、遺伝子発現プロファイルの変化を引き起こしたゲノムの進化的変化を予測するために必要となる。特定のゲノム領域が機能する際、その領域のクロマチンがオープンになることが知られており、クロマチンがオープンになっているゲノム領域は次世代シークエンサーを利用したDHS-seqやATAC-seqという方法で網羅的に同定できる。よって、本研究課題にこの手法を導入し、脊椎動物種間で見られる形態的多様性に関わるゲノムの進化的変化を明らかにすることを目指す。研究代表者の受け入れ研究室には、DHS-seqやATAC-seqが既に確立されており、本研究課題にもすぐに導入できる。
すべて 2015
すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (2件)
Cell Reports
巻: 12 ページ: 1887-1901
10.1016/j.celrep.2015.08.028.
