| 研究実績の概要 |
Runx2のエンハンサーの解析と追加同定
Runx2遺伝子領域のBACクローンを順次欠失させたGFPトランスジェニックマウスを作成することにより、Runx2 P1-5’down stream（１個）とRunx2 P2-3’up stream（２個）に新たな候補エンハンサーを特定した。これらは、Hsp68 minimal promoterと結合させたGFPトランスジェニックマウスを作成することにより、軟骨細胞での発現を確認した。現在CRISPR/Cas9システムを用いて、ノックアウトマウスを作成中である。さらに、Runx2遺伝子領域のクロマチン免疫沈降シーケンス（ChIP-Seq）既存データベースから骨芽細胞でのクロマチン修飾（H3K27ac, H3K4m1, H3K4m2, H2A.Z）を検討し、１４個の候補エンハンサーを決定した。また、この１４領域の候補エンハンサーのうち、8領域に関しては、CRISPR/Cas9システムを用いてそれぞれを欠失するマウスを２系統ずつ作成することに成功した。そのうち4領域（Runx2+0.18, 0.36, 0.46 と 0.77kb） のノックアウトマウスにおける骨・軟骨の表現型解析を行った。各発生段階 (E15.5の長管骨:主に軟骨細胞からなる; E16.5の長管骨:軟骨細胞と骨芽細胞からなる；E18.5の頭蓋:骨芽細胞からなる)でのRunx2遺伝子発現解析および8週齢マウスの大腿骨のマイクロ CT解析を行ったが、これらの欠失マウスでは、Runx2遺伝子発現の低下、骨形成の低下はともに認めなかった。現在、残り4領域の欠失マウスの解析及び６領域の欠失マウスの作成を行っている。また、Runx2遺伝子領域のクロマチン修飾を詳細に調べるために、骨・軟骨組織、初期培養骨芽細胞、軟骨細胞のマイクロマス培養からChIP-Seq用のサンプル採取をほぼ終了している。
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