| 研究課題/領域番号 |
15J07605
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
前田 海成 東京大学, 総合文化, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-24 – 2018-03-31
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| キーワード | シアノバクテリア / セルロース / 細胞外多糖 / 多糖合成 |
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| 研究実績の概要 |
主な成果は大きく分けて２つである。
１つ目は、好熱性シアノバクテリアThermosynechococcus vulcanus(以下T. vulc)の細胞外セルロース合成系の新規因子の同定である。本研究を開始する段階では、T. vulcにおいてセルロース合成酵素Tll0007と協同的に働く因子の候補はHlyD様蛋白質であるTlr0903のみを想定していたが、シンテニー解析により新たにエンドグルカナーゼとされるTlr1902も候補に加えた。これら３つの因子と、セルロース合成に必要なc-di-GMPというセカンドメッセンジャーを供給する酵素Tlr1210の様々な組み合わせの変異株を作製し、細胞凝集や細胞外セルロース蓄積量の評価をおこなった。その際、新たにイオン液体を用いたセルロースの抽出法を確立し用いた。Tlr0903とTlr1902のどちらの破壊株でも、低温青色光条件下で野生株が示すセルロース依存性細胞凝集が強く阻害された。またTlr1210とTlr0903を同時に過剰発現した株は、通常培養条件であっても細胞外セルロースの蓄積により非常に強く凝集した。これらの結果は、Tlr0903とTlr1902が細胞外セルロース合成系を構成する重要な因子であることを示している。既知のバクテリアの細胞外セルロース合成系やその他の分泌装置との比較により、T. vulcでは独自の細胞外セルロース合成酵素複合体を形成しているという仮説を立てている。
２つ目は、セルロース合成の基質を供給する酵素UDP-グルコースピロホスホリラーゼのうちシアノバクテリアに特徴的なCugPのホモログが、プロテオバクテリアの一部にも存在することを系統解析と活性測定により示した。バクテリアとシアノバクテリアでは、GalUとCugPという二種類の酵素の獲得と取捨選択が進化の過程でおきた可能性が、系統解析から示唆される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
シンテニー解析によりT. vulcanusの細胞外セルロース合成に関わる因子を新たに予想し、その同定に必要な変異株の作製とセルロース定量法の確立をおこない、それらを組み合わせることで複数の新規因子を同定できた。この成果だけみれば、当初の予定よりも研究は進んだと言える。しかし一方で、生化学の面からセルロース合成酵素複合体の詳細を明らかにする研究には良い進展が見られなかった。これをふまえ、予定通りの進捗具合と判断する。
NTPトランスフェラーゼファミリーの活性測定に関しては、シアノバクテリア以外の種にもCugPが存在することを示した。この知見は、シアノバクテリアとバクテリアの間でのホモログ蛋白質の比較によって、蛋白質の構造と機能を理解するという生化学上の意義のみならず、進化を理解する上でも重要な意義があることを示している。よって、こちらも順調に研究が進行していると判断する。
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| 今後の研究の推進方策 |
T. vulcanusの細胞外セルロース合成と細胞凝集を誘導する低温青色光という環境要因のうち、低温が何を介して働いているかはこれまで不明であった。今回新たに同定したtlr0903とtlr1902の転写が低温で誘導されていれば、低温による誘導メカニズムを解明する大きな手掛かりとなる。そこで、RNAの抽出・精製と定量PCRの系を研究室で新たに立ち上げ、転写解析をする予定である。その後はTlr0903とTll0007が複合体を形成しているかの解明を試みるが、これまでの実験により複合体蛋白質を精製する手法は困難である可能性が考えられるため、細胞内での蛋白質の局在解析に手法を変える予定である。
セルロース以外の細胞外多糖合成系の解明にもとりかかる。具体的には、Tll0007と似た蛋白質であるTlr1795の機能解析や、Synechocystis sp. PCC 6803がc-di-GMP依存的に合成すると推測される細胞外多糖の合成系の解明を目指す。Tlr1795の多糖合成酵素としての機能や生理的役割は、T. vulcanusと、その近縁種であるT. elongatusで異なっている可能性が示唆されているため、研究材料としてT. elongatusも扱う。また、Synechocystis sp. PCC 6803では、c-di-GMP合成酵素の恒常的な強い発現は細胞死に繋がるため、誘導型プロモーターを用いた系の構築に着手している。
細胞外多糖合成の基質を供給する酵素である、NTPトランスフェラーゼファミリーに関する研究では、これまでの研究によりシアノバクテリアにおいて未同定のNDP-sugarピロホスホリラーゼは１つのサブファミリーを残すのみとなった。今後は、そのファミリーの酵素の同定や生化学解析をおこなうことによって、細胞外多糖合成における多様性の解明に迫っていきたい。
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