| 研究課題/領域番号 |
15J08253
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
新妻 耕太 筑波大学, グローバル教育院, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-24 – 2018-03-31
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| キーワード | CD300ファミリー受容体 / パトローリング単球 / 骨髄球形樹状細胞 / SNP |
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| 研究実績の概要 |
ヒト新規免疫受容体 CD300H の機能を in vitro において解析し、ヒト生体内における役割を明らかにする。昨年度 CD300H がパトローリング単球と骨髄球系樹状細胞に発現し活性化シグナルを伝達することを明らかにした。次に、CD300Hの生理的役割を明らかにするためリガンドの同定を試みた。
近年 CD300 分子群はリン脂質をリガンドとして認識する性質を持つ事が近年明らかになっている(John P, et al, Immunogenetics. 2012.)。そこでCD300H の細胞外部位とヒト IgG のFc 部位を融合させたキメラタンパク質をプローブとしてリガンドの探索を試みた。15種類のリン脂質がメンブレンにプロットされているPIP ストリップに対し CD300H キメラタンパク質を結合させ、HRP標識された抗ヒトIgG抗体で検出した。その結果、CD300H キメラタンパク質は脂質Xに強い結合を示すことがわかった。
機能的なリガンドのスクリーニング系を立ち上げる目的でCD300H のレポーター細胞の樹立を試みた。昨年度の成果から CD300H は、ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activating motif) を有するアダプタータンパク質である DAP12と会合することがわかっている。そこで、DAP12 を強制発現させた、2B4 NFAT-GFP レポーター細胞にCD300H を強制発現させた。 CD300H を高発現する細胞集団をセルソーターで分離し安定株を樹立した。 プレートコートした抗 CD300H 抗体でこの細胞を刺激すると約70 % が GFP 陽性細胞となることを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
CD300Hのリガンド探索の研究において、脂質が候補であることを明らかにした。さらに、リガンド結合により蛍光を発するレポーター細胞を樹立できた。研究目的を達成するための重要なツールの作成という進展が見られた。
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| 今後の研究の推進方策 |
① CD300H キメラタンパク質と脂質 X の結合解析 (ELISA)
脂質X をエタノールに溶解し、ELISA プレートにプレートコート後、CD300H キメラタンパク質が濃度依存的に結合を示すか検討する。またCD300H キメラタンパク質が結合した場合、抗CD300H 抗体がその結合をブロックするかどうか検討する。
② CD300H レポーターを用いた機能実験
脂質X が細胞上の CD300H を刺激してシグナルを伝達するかを検討する。 脂質Xをエタノールに溶解しプレートコート後、CD300H レポーター細胞を培養し24時間後のGFP陽性細胞の割合をフローサイトメトリー法で解析する。また脂質X がシグナルを伝達した場合、抗CD300H 抗体がその結合をブロックするかどうか検討する。
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