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本研究では哺乳類の受精における膜融合を担う卵子側の因子であるJunoと、精子側の因子であるIzumo1の細胞外ドメインについて、X線結晶構造解析によって複合体の立体構造を決定し、JunoによるIzumo1認識メカニズムを解明することを目的とする。本年度はマウス由来JunoおよびIzumo1につい結晶化スクリーニングを行った。
本研究員はマウス由来のJunoおよびIzumo1について、ショウジョウバエ由来S2細胞を用いたJunoおよびIzumo1の発現系の構築に成功している。これにより1 Lの培養上清から高純度に精製されたマウス由来のJunoおよびIzumo1をそれぞれ1 mg以上得ることに成功した。得られた精製Junoと精製Izumo1を1:1の比率で混合し、結晶化スクリーニングを行ったが現在までに結晶は得られていない。2016年にNatureに発表されたOhtoらによる論文、およびAydinらによる論文によると、ヒト由来のJunoおよびIzumo1はゲル濾過カラムクロマトグラフィー上で結合し、複合体に由来するピークを形成することがわかっている。一方、本研究において使用しているマウスに由来するJunoおよびIzumo1は、混合してゲル濾過カラムクロマトグラフィーにかけると複合体に由来するピークは得られなかった。そのため今後はマウス由来のJunoおよびIzumo1の複合体の結晶を得るためには、二者の結合を等温滴定カロリメトリー(ITC)や表面プラズモン共鳴（SPR）などにより定量し、その度合いをヒト由来JunoおよびIzumo1の結合強度と比較する必要があると考えられる。十分な結合が確認できなかった場合には、結晶化に用いるタンパク質の濃度の検討や、タンパク質表面のリジン残基のメチル化などにより、結晶構造解析にむけて結晶化を促進するための処理を行う必要がある。
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