| 研究課題/領域番号 |
15J09770
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
辻 将吾 京都大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC2)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-24 – 2017-03-31
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| キーワード | TALE / エピジェネティクス / DNAメチル化 / メチル化シトシン / 分子進化 / タンパク質工学 |
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| 研究実績の概要 |
DNAメチル化、特にシトシン5位炭素のメチル化は重要なエピジェネティック制御機構である。このメチル化シトシン（5mC）は、遺伝子発現、ゲノム安定性などを制御する因子であり、癌化、発生、分化など様々な生命現象に関わっている。しかし、メチル化が生じるタイミングや、メチル化状態の変遷、それらと細胞現象との関連等に関しては未だ不明な点が多い。本研究では生細胞内での5mC機能に迫るため、またメチル化の時間的情報を得るために、生細胞内で個々の5mCを直接認識できる分子ツールの開発を目的とする。
生細胞内ゲノムを部位特異的に認識するツールとしてDNAに配列特異的に結合するタンパク質であるTranscription activator-like effector (TALE) に着目した。TALEはA、T、G、C、4種のいずれか1塩基に結合するユニットを複数並べることで任意のDNA配列に結合するよう容易に設計可能である。しかし、5mCに高い選択性で結合するユニットは報告されていない。そこでTALEを5mC認識ツールとして利用するため、既存のTALEユニットに改変を加えることで、5mC選択的に結合するユニットの創製を目指した。
本年度は、ランダム化ユニットを含むTALEを発現するプラスミドライブラリーの作製、及びそのスクリーニングに取り組んだ。まず天然ユニットを改変するにあたり、TALE結晶構造を精査し、塩基認識に重要であると推測されたユニット可変アミノ酸とその前後、計４つのアミノ酸をランダム化することとした。ランダム化プラスミドライブラリーを作製した。Bacterial one-hybrid screeningを用いてライブラリーのスクリーニングを行い複数の候補変異体ユニットを獲得した。これらの変異体ユニットの５ｍC選択性をルシフェラーゼアッセイ、ゲルシフトアッセイにより評価したところ、得られた変異体ユニットの中には5mC選択性が高いものが含まれていることがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は予定通りプラスミドライブラリーの構築とそのスクリーニングを行うことができた。ライブラリーが適切にランダム化されていることが次世代シークエンサーによる解析から確認できた。一方でスクリーニングにおいては当初、全く陽性変異体が得られないという問題があったが、レポーター配列、培地成分などの検討を行い適切な条件を決定することで複数の変異体を獲得することができた。また得られた変異体ユニットにおいては天然ユニットに比べて５ｍC選択性が高く、スクリーニング法が適切に機能していることが示唆された。また今回得られた変異体ユニットの配列パターンから、グリシン、アラニン、など比較的小さなアミノ酸を含むことが５ｍC選択性ユニットの重要要件である可能性があるとの知見が得られた。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在までに５ｍC選択性が高い変異体ユニットを獲得することに成功しているが、その活性は不十分であり、さらなる候補変異体の獲得が必要である。これまでに判明した５ｍC選択性が高い変異体ユニットの配列傾向を参考に、再度ライブラリーを構築、スクリーニングを行うことで、より５ｍC選択性が高い変異体ユニットを獲得することを目指す。最適な変異体ユニットが得られた後には、変異体ユニットを用いて哺乳細胞ゲノムDNAのメチル化領域を標的としたTALEを作製する。このTALEに関して1)転写活性化ドメインとTALEとの融合タンパク質による標的領域遺伝子の活性化機能の評価、2）クロマチン免疫沈降法によるTALE結合部位の同定、を行い、ゲノムDNAへのメチル化依存的な結合性を評価する。これらの結果から、創製した変異体ユニットが実際に生細胞内でのメチル化検出ツールとして使用可能であるか判断する。
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